短日照敏感型細(xì)胞死亡SSD1基因及其編碼蛋白與應(yīng)用制造技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)公開(kāi)了一種短日照敏感型細(xì)胞死亡SSD1基因及其編碼蛋白與應(yīng)用，所述SSD1基因具有如SEQ?ID?NO：1所示的序列。本發(fā)明專利技術(shù)是以模式植物擬南芥為試驗(yàn)材料，通過(guò)EMS誘變，篩選獲得一個(gè)短日照敏感型細(xì)胞死亡突變體ssd1。采用圖位克隆法分離該基因，并發(fā)現(xiàn)了基因突變位點(diǎn)，該基因的缺失在短日照條件下導(dǎo)致了細(xì)胞死亡。SSD1基因是擬南芥在短日照條件下生長(zhǎng)所必需的，且在植物中具有廣泛的同源性。該基因生物學(xué)功能的發(fā)現(xiàn)以及同源基因的相關(guān)研究有助于深化光周期調(diào)控植物細(xì)胞死亡的研究，對(duì)探討植物細(xì)胞死亡的分子機(jī)理具有重要的科學(xué)意義，同時(shí)對(duì)短日照地區(qū)作物品種改良具有重要的應(yīng)用價(jià)值。

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】

本專利技術(shù)涉及植物基因工程領(lǐng)域，具體為一種短日照敏感型細(xì)胞死亡SSDl基因及其編碼蛋白與應(yīng)用。
技術(shù)介紹
細(xì)胞死亡是生物體的一種常見(jiàn)的生命現(xiàn)象。細(xì)胞因受到嚴(yán)重?fù)p傷而累及胞核時(shí)，呈現(xiàn)代謝停止、結(jié)構(gòu)破壞和功能喪失等不可逆性變化，此即細(xì)胞死亡。一般來(lái)講，細(xì)胞死亡可分為兩種類型生理性死亡(physiological cell death)和非生理性死亡(nonphysiological cell death)。生理性死亡是由細(xì)胞內(nèi)的死亡程序所控制的細(xì)胞死亡，生物在其生長(zhǎng)發(fā)育及形態(tài)建成過(guò)程中，利用生理性死亡控制細(xì)胞的數(shù)目，或作為一種防御 機(jī)制清除被感染、被誘變或被損傷的細(xì)胞。非生理性死亡是生物在生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中由于意外的外界因素如激光照射、有毒物質(zhì)傷害或營(yíng)養(yǎng)缺乏等，或者由于生物體內(nèi)的缺陷如產(chǎn)生ATP的酶突變，或者突變后的基因產(chǎn)物對(duì)細(xì)胞具有毒害作用等原因引起的細(xì)胞死亡(Vauxand Korsmeyer, 1999)。因此,導(dǎo)致生物體細(xì)胞死亡的機(jī)制非常復(fù)雜。目前關(guān)于植物細(xì)胞死亡的遺傳調(diào)控機(jī)制有了一定的進(jìn)展，近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)光周期也會(huì)調(diào)控植物的細(xì)胞死亡。在擬南芥中，Dietrich等篩選了一系列受光照調(diào)控的細(xì)胞死亡突變體，其中Isdl和lsd3的細(xì)胞死亡在短日照條件下受到抑制，而lsd2和lsd5的細(xì)胞死亡在長(zhǎng)日照條件下受到抑制(Dietrich et al. , 1994) ;Ishikawa等分離出的三個(gè)細(xì)胞死亡突變體，其中Ienl和len3只在短日照條件下導(dǎo)致細(xì)胞死亡(Ishikawa etal., 2003; Ishikawa et al.，2006)，而lin2在所有的生長(zhǎng)條件下都會(huì)發(fā)生細(xì)胞死亡，但在長(zhǎng)日照條件下較嚴(yán)重(Ishikawa et al.，2001);突變體atipsl是肌醇合成的關(guān)鍵酶基因發(fā)生突變，同時(shí)其細(xì)胞死亡依賴于光照長(zhǎng)度(Meng et al. , 2009) ;flul突變體在由黑暗轉(zhuǎn)為光照培養(yǎng)時(shí)，也會(huì)迅速表現(xiàn)出白化和壞死(Meskauskiene et al.，2001)。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
針對(duì)以上的
技術(shù)介紹
，本專利技術(shù)提供一種短日照敏感型細(xì)胞死亡SSDl基因及其編碼蛋白與應(yīng)用，所述SSDl基因具有如SEQ ID NO :1所示的序列。其中，所述SSDl基因編碼序列如SEQ ID NO :3所示，其編碼的氨基酸序列如SEQID NO 5 所示。其中，所述SSDl基因的應(yīng)用，是SSDl基因在光周期調(diào)控植物細(xì)胞死亡中的應(yīng)用。其中，所述SSDl基因的應(yīng)用，是SSDl基因在轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用。其中，所述SSDl基因的應(yīng)用，是該基因的功能喪失在光周期調(diào)控植物細(xì)胞死亡中的應(yīng)用。其中，所述SSDl基因的應(yīng)用，是植物中其同源基因的研究在光周期調(diào)控植物細(xì)胞死亡中的應(yīng)用。本專利技術(shù)是以模式植物擬南芥為試驗(yàn)材料，通過(guò)篩選EMS誘變的突變體庫(kù)，在短日照條件下篩選得到一個(gè)細(xì)胞死亡突變體，命名為短日照敏感型細(xì)胞死亡突變體(short-daysensitive cell death mutant l，ssdl)。采用圖位克隆法分離SSDl基因，并發(fā)現(xiàn)了該基因突變位點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，SSDl基因的突變?cè)诙倘照諚l件下導(dǎo)致了細(xì)胞的死亡，SSDl基因是擬南芥在短日照條件下生長(zhǎng)所必需的，且在植物中具有廣泛的同源性。進(jìn)一步，本專利技術(shù)通過(guò)試驗(yàn)表明，SSDl基因具有在短日照條件下調(diào)控植物細(xì)胞死亡的功能，該基因生物學(xué)功能的發(fā)現(xiàn)以及同源基因的相關(guān)研究有助于深化光周期調(diào)控植物細(xì)胞死亡的研究，對(duì)探討植物細(xì)胞死亡的分子機(jī)理具有重要的科學(xué)意義，同時(shí)對(duì)短日照地區(qū)作物品種改良具有重要的應(yīng)用價(jià)值。附圖說(shuō)明圖I是短日照條件下ssdl突變體和野生型(Col-O)的表型圖(Bar=5cm)。圖2是短日照條件下ssdl突變體的白化死亡的莖桿、葉片及果莢圖(Bar=lcm)。 其中左圖為莖桿；右上圖為葉片；右下圖為果莢。圖3是ssdl突變體在MS培養(yǎng)基(含1%蔗糖)上的種子萌發(fā)及幼苗的白化死亡表型圖。其中LD表示長(zhǎng)日照；SD表示短日照；d為天數(shù)；四副小圖皆為野生型(Col-O)與ssdl突變體的對(duì)照?qǐng)D，左側(cè)為野生型，右側(cè)為ssdl突變體。圖4是轉(zhuǎn)基因植株的互補(bǔ)驗(yàn)證圖。圖5是蓮座葉的臺(tái)盼藍(lán)染色圖(Bar=250 μ m)。具體實(shí)施例方式實(shí)施例I :擬南芥EMS誘變與篩選一、化學(xué)誘變處理將擬南芥野生型(Col-O)種子置于重蒸水中攪拌30分鐘，在4°C下放置12小時(shí)后，把種子轉(zhuǎn)移到IOOmM的磷酸緩沖液(pH6. 5)中，加入O. 2% (v/v)的甲基磺酸乙酯(EMS)，封口后放在水浴(25°C)振蕩器上振蕩12hr，然后用蒸餾水漂洗種子。二、誘變植株培養(yǎng)將漂洗好的種子置于4°C下春化3天，播種于人工土壤(東北黑土 蛭石=1 :1，V/V)中。在光照培養(yǎng)室生長(zhǎng)，培養(yǎng)溫度22±2°C ;光照強(qiáng)度80-120 μ Hi0InT2iT1 ;相對(duì)濕度65% ；光周期為16小時(shí)光照、8小時(shí)黑暗。采收成熟種子即M1代，M1代自交收種得M2代，干燥備用。三、突變體的篩選將M2代種子表面消毒、用無(wú)菌水沖洗后，點(diǎn)播于MS培養(yǎng)基上。在4°C黑暗下春化3天，轉(zhuǎn)入長(zhǎng)日照條件(16小時(shí)光照、8小時(shí)黑暗)下生長(zhǎng)。培養(yǎng)一周轉(zhuǎn)入人工土壤，生長(zhǎng)2-3周，然后轉(zhuǎn)入短日照條件(8小時(shí)光照、16小時(shí)黑暗)下，生長(zhǎng)4-7天，從中篩選出現(xiàn)細(xì)胞死亡的植株，然后轉(zhuǎn)入正常光照條件下(即長(zhǎng)日照條件)生長(zhǎng)，單株收獲種子(M3)。在相同條件下再分別對(duì)M3代株系進(jìn)行篩選，鑒定出一個(gè)穩(wěn)定遺傳的株系，命名為短日照敏感型細(xì)胞死亡突變體(short-day sensitive cell death mutant l，ssdl)。在長(zhǎng)日照條件下，該突變體的表型與擬南芥野生型(Col-O)沒(méi)有明顯差異；但將其轉(zhuǎn)入短日照條件下，該突變體的表型出現(xiàn)異常，見(jiàn)圖1，生長(zhǎng)受到抑制，植株葉片、幼嫩的莖、花序和果莢會(huì)發(fā)生部分萎蔫進(jìn)而白化死亡，見(jiàn)圖2，但不導(dǎo)致植株整體死亡，可結(jié)少量種子。專利技術(shù)人繼續(xù)觀察比較該突變體與野生型(Col-Ο)，發(fā)現(xiàn)鋪種在含1%蔗糖的MS培養(yǎng)基上的ssdl突變體的種子萌發(fā)不受光周期的影響，但是I周以后大部分突變體幼苗出現(xiàn)白化死亡,見(jiàn)圖3。實(shí)施例2 圖位克隆法分離SSDl基因一、圖位克隆群體的構(gòu)建將ssdl突變體(Col-Ο背景)與另一生態(tài)型Landsberg erecta (Ler)進(jìn)行雜交，得到F1代雜合體A代雜合體自交，得到&代；播種F2代種子，在短日照條件下篩選出現(xiàn)細(xì)胞壞死的個(gè)體，在同一個(gè)育苗盤(pán)中同時(shí)鋪種一行ssdl突變體作為對(duì)照。共收集了 2500株F2遺傳群體用于基因的圖位克隆。二、分子標(biāo)記的選擇與設(shè)計(jì)根據(jù)TAIR網(wǎng)上(www. arabidopsis. org)公布的擬南芥全基因組DNA多態(tài)性數(shù)據(jù)庫(kù)，選擇了分子標(biāo)記NT7123, EAT，F(xiàn)21M12, NGA63, F16J7-TRB，JV18/19, F21J9-83201。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，設(shè)計(jì)了分子標(biāo)記SGCSNP9772，見(jiàn)表I。此外，基于TAIR網(wǎng)上CACP(CereonArabidopsis polymorphism Collection)釋放的Ler已測(cè)序的表達(dá)序列標(biāo)簽(EST)與Col-O序列進(jìn)行比對(duì)，找出InDels位點(diǎn)，設(shè)計(jì)了 3對(duì)SS本文檔來(lái)自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種短日照敏感型細(xì)胞死亡SSD1基因，其特征是所述SSD1基因具有如SEQ？ID？NO：1所示的序列。

【技術(shù)特征摘要】

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：任春梅，彭文，韓成云，謝道昕，朱旗，彭志紅，陳峰，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)，
類型：發(fā)明
國(guó)別省市：