一種鮸微衛星分子標記的篩選方法技術

本發明專利技術涉及一種鮸微衛星分子標記的篩選方法，包括：（1）鮸基因組DNA的提取并稀釋備用；（2）設計5’錨定引物及PCR擴增；（3）擴增產物的克隆及測序；（4）序列分析及微衛星特異引物設計；（5）使用上述微衛星特異引物對鮸基因組DNA進行PCR擴增；（6）使用質量濃度6%的變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測步驟（5）得到的PCR擴增產物；根據擴增產物的不同遷移距離確定每個個體的基因型，共獲得9個多態性的微衛星標記，從而獲得鮸遺傳變異的多態性圖譜。本發明專利技術操作簡單、安全、陽性率高、結果真實可靠，可快速獲得鮸遺傳變異的多態性圖譜，主要應用于鮸遺傳變異及遺傳多樣性分析。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術屬于鯢的微衛星分子標記領域，特別涉及一種鯢微衛星分子標記的篩選方法。
技術介紹
微衛星DNA(Microsatellite DNA)廣泛存在于真核生物基因組中，由1-6個核苷酸組成的簡單序列重復(Simple Sequence Repeats, SSR),微衛星具有數量多、隨機分布、多態性高、重復性強、呈共顯性遺傳及操作簡單等優點，是近年發展起來的一種新型分子標記技術，被廣泛地應用于群體遺傳多樣性分析、種質資源保護與管理、遺傳連鎖圖譜構建及QTL定位等領域中。國內外學者已在許多重要水產動物中開發了微衛星標記。如ΖΗΑΝ等開發了海參的45個多態微衛星標記；Gen等開發了鯉魚的36個多態微衛星標記；CRISP0等開發了雜色褶唇麗魚的18個微衛星標記；K0IZUMI等開發了短棘九刺魚的25個多態微衛星標記；這些多態微衛星標記已經被廣泛地應用到群體遺傳結構分析、親緣關系鑒定、遺傳連鎖圖譜構建等研究中。鏡(Miichthysmiiuy)屬脊索動物門(Chordata),硬骨魚綱(Osteichthyes),魚盧形目(Perciformes),石首魚科(Sciaenidae),鯢屬(Miichthys),分布在西北太平洋區，包括中國、日本、韓國、越南等國海域。在我國沿海均有分布，但以東、黃海較多。其肉味鮮美，營養豐富，深受國內外消費者的喜愛。其鰾俗稱“魚肚”，為高級滋補品，具有較高的食用和藥用價值。由于其生長快、自然抗逆性強、市場潛力大等優點，近年來其人工繁殖與養殖在我國南方沿海正蓬勃發展，有望成為深水網箱養殖的優良品種。為了弄清野生鯢群體的遺傳多樣性和種質資源狀況，從而促進鯢的資源保護和人工養殖的可持續發展，需對其遺傳背景及多樣性狀況進行研究。目前，可利用的鯢微衛星標記數量非常少，嚴重限制了相關遺傳學研究的發展。
技術實現思路
本專利技術所要解決的技術問題是提供一種鯢微衛星分子標記的篩選方法，該方法操作安全、簡單、陽性率高、結果真實可靠，可快速獲得鯢遺傳變異的多態性圖譜。本專利技術的一種鯢微衛星分子標記的篩選方法，包括(I)鯢基因組DNA的提取并稀釋備用；(2 )設計5 ’錨定引物及PCR擴增；(3)擴增產物的克隆及測序；(4)序列分析及微衛星特異引物設計；(5)使用上述微衛星特異引物對鯢不同地理群體或群體內個體的基因組DNA進行PCR擴增；(6)使用質量濃度6%的變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測步驟(5)得到的PCR擴增產物；根據擴增產物的不同遷移距離確定每個個體的基因型，共獲得9個多態性的微衛星標記，從而獲得鯢遺傳變異的多態性圖譜。所述步驟(I)中的鯢基因組DNA的提取包括以下步驟剪取鯢(采集于浙江舟山市近海海域)少量肌肉組織100-150mg，置于500 μ L組織提取液的中剪碎，加入終濃度為20mg/mL的蛋白酶K和終濃度為100 μ g/mL的RNase A, 55 °C消化2_3個小時；用體積比為25 24 1的苯酚氯仿異戊醇混合液抽提兩次；然后用900 μ L的無水乙醇沉淀DNA，經70%乙醇洗滌和自然干燥后，溶解于TE中；最后將DNA濃度稀釋為IOOng/μ L，并保存在-20°C備用。所述步驟(2)中的設計5’錨定引物包括以下步驟設計含有兼并堿基及重復堿基的引物，其中兼并堿基部分具有錨定作用，防止引物與模板的結合發生滑動，重復堿基部分為2個堿基6次重復，用于與基因組DNA中的重復堿基結合；采用的5’錨定引物有PAC6 5，-KKDBDBD (AC) 6_3，， PAG6 5，-KKHBHBH (AG) 6_3，，PCT6 5 ’ -KKVRVRV (CT) 6_3 ’，PGT6 :5，-KKRVRVR(GT)6_3，；所述的PCR擴增包括以下步驟每個5’錨定引物以鯢基因組DNA為模板進行PCR擴增，反應體系為25 μ L，包括基因組DNA模板I μ L、5’錨定引物終濃度為O. 8 μ mol/L、Mg2+終濃度為 I. 5mmol/L、dNTP 終濃度為 O. 2mmol/L、Taq DNA 聚合酶 O. 75U、I X PCRbuffer，最后補充滅菌雙蒸水至總體積為25 μ L ;反應程序為94°C預變性5分鐘，94°C變性30秒、弓丨物特異的退火溫度退火50秒、72°C延伸50秒，30個循環；最后于72°C延伸7分鐘；用I. 5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測預擴增產物，并回收大小在200-750bp之間的擴增產物。所述步驟(3)中的克隆及測序包括以下步驟首先是將步驟(2)得到的回收的PCR產物連接到PMD19-T載體(TaKaRa)中，然后轉化到大腸桿菌感受態細胞DH5 α中，接種到LB (Amp+)培養基中生長，再利用載體通用引物和PCR擴增法鑒定陽性克隆，挑取插入片段大小在200-750bp的陽性克隆利用ABI3730自動測序儀進行測序。所述步驟(4)中的序列分析及微衛星特異引物設計包括以下步驟首先利用生物學軟件DNAMAN 4. O對所獲得的所有序列進行比對分析，去掉相同的序列；然后利用生物學軟件SSRHUNTER I. 3查找含有微衛星核心重復的序列；再利用BLAST方法搜索上述含有微衛星核心重復的序列在GenBank數據庫中是否存在相同的序列，并去掉那些相同的序列；最后利用生物學軟件Primer Premier 5. O對含有完整側翼區的微衛星序列進行引物設計；其中，所述的鯢微衛星分子標記及其對應的特異引物序列，如下所示Miml1CATCTAATCT TCCCTTACCT CTGCAGCTGC GTGTGATATC CTTTGGGACAAAAAACGTAG61TGGGGAGAAA ACTTCAGCTT CAACAGCACT GCTACAGATC CTCACTTTCTAGCTCTTTCC121AAGGTAACGT ATCTTTCAGC CCAAACACAC ACACGCACTT CAGTCCACTATGACAGCGCT181CTGTCTACCT GCGTGAGCTT GTGTAAATGT ATCCTAGATG GTGATGAATAGTGGTGAGTG241AAAGCAGAAT ACTMiml標記的特異引物序列F:CATCTAATCTTCCCTTACCTCTGR:AGTATTCTGCTTTCACTCACCACMim21AGAAAGAAGA GTCCGACCAC CAACCGGGTT TTGATCAGCT GTTGTTGGAG TTTGCGCCGG61AGTGATGTTC CTGCGCTCTT AGCGAGAGGA GAAACAGACG GAGAGAGAGAGAGGGAGAGA121GACAGAGAGA GAGAGGGAGA GAGAGGAGGT GAAGACGCCG GTTTGTTGTTGTCGCCTTGT181CCGCTGGACT GACATCGCAT GGGGACATGA ACAGTGTGGA TCMim2標記的特異弓丨物序列F:AGAAAGAAGAGTCCGACCACCAACCR:GATCCACACTGTTCATGTCCCCATGMim31GGAAGGACAG GGAGAAAGAA AATATGGAAG GAAGGAAGGA AGGAAGGAAGGAAGGAAGGA61本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種鮸微衛星分子標記的篩選方法，包括：（1）鮸基因組DNA的提取并稀釋備用；（2）設計5’錨定引物及PCR擴增；（3）擴增產物的克隆及測序；（4）序列分析及微衛星特異引物設計；（5）使用上述微衛星特異引物對鮸基因組DNA進行PCR擴增；（6）使用質量濃度6%的變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測步驟（5）得到的PCR擴增產物；根據擴增產物的不同遷移距離確定每個個體的基因型，共獲得9個多態性的微衛星標記，從而獲得鮸遺傳變異的多態性圖譜。

【技術特征摘要】

【專利技術屬性】
技術研發人員：馬春艷，馬洪雨，馬凌波，宋煒，張鳳英，蔣科技，
申請(專利權)人：中國水產科學研究院東海水產研究所，
類型：發明
國別省市：