本發(fā)明專利技術(shù)涉及一種檢測MPL基因W515位點突變含量的試劑盒，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。所述試劑盒包含MPL基因W515L位點突變特異性體系和MPL基因W515K位點突變特異性體系中至少一種體系及內(nèi)參基因ABL體系，所述體系均包括上游引物、下游引物和Taqman熒光探針。研究表明MPL基因W515L位點突變和MPL基因W515K位點功能獲得性突變率在PMF和ET中分別為10%和3%，而在PV中從未出現(xiàn)。因此，MPL基因W515L位點突變和MPL基因W515K位點突變主要用于診斷PMF和ET。采用敏感性及特異性均較高的熒光定量PCR檢測MPL基因W515L位點突變和MPL基因W515K位點突變，其檢測結(jié)果的特異性和敏感度均顯著提高。本發(fā)明專利技術(shù)試劑盒為預(yù)測骨髓增殖性疾病的診斷提供了一種全新的快速簡便的基因診斷技術(shù)。
【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)涉及生物
的熒光定量PCR技術(shù)，具體涉及一種定量檢測MPL基因W515位點突變的試劑盒。
技術(shù)介紹
骨髓增殖性疾病(myeloproliferative diseases, MPD)是骨髓組織持續(xù)異常增殖之后，造成紅細胞和血小板過多，以及骨髓纖維化問題的疾病。根據(jù)2008年WHO (WorldHealthOrganization,世界衛(wèi)生組織)的修訂，將骨髓增殖性疾病改為骨髓增殖性腫瘤(myeloproliferative, MPN)。MPN 中包括真性紅細胞增多癥(Polycythemia Vera, PV),原發(fā)性血小板增多癥(Essential Thrombocytosis, ET)和原發(fā)性骨髓纖維化(primarymyelofibrosis, PMF)，它們均是血細胞過度增殖的疾病，如若不及時治療，最終會發(fā)展成為急性粒細胞性白血病。因此,早期快速診斷對病人疾病的發(fā)生發(fā)展起關(guān)鍵性作用。2008年WHO修訂MPN診斷標(biāo)準(zhǔn)的依據(jù)是多數(shù)患者都具有JAK2基因突變，主要是JAK2基因V617F和JAK2基因外顯子12突變。研究表明JAK2基因V617F是診斷為PV的敏感指標(biāo)，也見于50%的ET和PMF中。但是不能排除JAK2基因V617F陰性卻患有MPN的可能性。隨后在JAK2V617F陰性的MPN患者中發(fā)現(xiàn)促血小板生成素受體MPL基因突變，包括MPL基因W515L位點突變和W515K位點突變。該基因是骨髓增殖性白血病病毒同源性致癌基因，屬于促紅細胞生成素超級家族，可促使促血小板生成素配體(Thromboietin，ΤΡ0)全身造血和巨核細胞生長與分化，此基因位于染色體lq34并包含12個外顯子。2006年，人體MPL基因W515L位點突變是在JAK2基因V617F陰性的PMF中被發(fā)現(xiàn)，突變位于第10外顯子中，在1544號核苷酸處G轉(zhuǎn)變成T，致使橫跨膜區(qū)域515密碼子有色氨酸轉(zhuǎn)變成亮氨酸。此后，又發(fā)現(xiàn)在1543與1544處核苷酸由TG轉(zhuǎn)變?yōu)锳A即MPL基因W515K位點突變。盡管之后又在第10外顯子中發(fā)現(xiàn)其它突變，但是只有MPL基因W515位點的突變會誘導(dǎo)模仿JAK2基因V617F的功能，發(fā)展成MPN。MPL基因W515L位點和MPL基因W515K位點的功能獲得性突變率在PMF和ET中分別為10%和3%，而在PV中從未出現(xiàn)。因此，MPL基因W515L突變和W515K位點突變主要用于診斷PMF和ET。在JAK2基因V617F陰性的患者中，檢測MPL基因W515L突變和W515K位點突變有助于MPN的診斷。使用等位基因特異性熒光定量PCR(Polymerase ChainReaction,聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))檢測技術(shù)，其敏感性顯著高于直接測序。實時熒光定量PCR技術(shù)實現(xiàn)了PCR從定性到真正意義的定量的飛躍，為人類疾病基因的定量檢測提供了一個行之有效的檢測工具，與普通PCR相比具有特異性增強、靈敏度提高和檢測快速、降低了污染等特點，但目前尚未有實時熒光定量PCR方法檢測MPL基因W515位點突變試劑盒的相關(guān)報道。
技術(shù)實現(xiàn)思路
為了解決現(xiàn)有技術(shù)的問題，本專利技術(shù)實施例提供了一種檢測MPL基因W515L位點突變和MPL基因W515K位點突變的試劑盒。所述技術(shù)方案如下CN 102925559 A書明說2/9頁本專利技術(shù)實施例提供了一種檢測MPL基因W515位點突變的試劑盒，包括檢測用引物、熒光探針、熒光定量PCR混合液、陰性對照和陽性對照，所述檢測用引物、熒光探針包括MPL基因W515L位點突變特異性引物和MPL基因W515K位點突變特異性引物中的至少一種和內(nèi)參基因ABL引物及Taqman熒光探針，其中MPL基因W515L位點突變特異性上游引物序列如序列表中SEQ ID NO: I所示；·MPL基因W515L位點突變特異性下游引物序列如序列表中SEQ ID NO: 2所示；MPL基因W515L位點突變特異性Taqman熒光探針如序列表中SEQ ID NO: 3所示；MPL基因W515K位點突變特異性上游引物序列如序列表中SEQ ID N0:4所示；MPL基因W515K位點突變特異性下游引物序列如序列表中SEQ ID NO: 5所示；MPL基因W515K位點突變特異性Taqman熒光探針如序列表中SEQ ID N0:6所示；ABL基因上游引物序列如序列表中SEQ ID NO: 7所不；ABL基因下游引物序列如序列表中SEQ ID N0:8所示；ABL基因Taqman滅光探針如序列表中SEQ ID NO:9所不；進一步地，所述試劑盒還包括內(nèi)部陽性控制序列、內(nèi)部陽性控制序列的引物和Taqman熒光探針，其中內(nèi)部陽性控制序列如序列表中SEQ ID NO: 10所示；內(nèi)部陽性控制序列的上游引物如序列表中SEQ ID NO: 11所示；內(nèi)部陽性控制序列的下游引物如序列表中SEQ IDNO: 12所示；內(nèi)部陽性控制序列的Taqman突光探針如序列表中SEQ IDNO: 13所示。進一步地，所述MPL基因W515L位點突變特異性Taqman熒光探針、MPL基因W515K位點突變特異性Taqman熒光探針和ABL基因的Taqman熒光探針的5’端連接有熒光報告基團FAM，3’端均連接有熒光淬滅基團TAMRA ;所述內(nèi)部陽性控制序列Taqman熒光探針的5’端連接有熒光報告基團TET，3’端連接有熒光淬滅基團TAMRA。具體地，所述內(nèi)參基因ABL的核酸序列如序列表中SEQ ID NO: 14所示。具體地，所述陰性對照為去離子水；所述陽性對照為含有MPL基因W515L位點突變和MPL基因W515K位點突變的基因組DNA樣品。具體地，所述熒光定量PCR的混合液(以反應(yīng)體系終濃度表示)為1X的PCR預(yù)混合液(原液為 2 XPCR Premix),2. 5-4. OmM 的 Mg2+、。· 2-0. 4mM 的 dNTPs、0. 3-0. 6mM 的 dUTP、O. 2U/ μ L的Taq酶和O. 01-0. 05U/ μ L的UNG酶以及無RNase去離子水。本專利技術(shù)試劑盒的優(yōu)點和效果如下(I)敏感性高可重復(fù)敏感度為O. 01%，即10000個細胞中有一個含MPL基因W515L位點突變和MPL基因W515K位點突變就可以被檢測出。(2)特異性強使用特異性探針對定量分子進行識別，準(zhǔn)確性高。同時，靶序列由弓I物和探針雙重控制，特異性好、假陽性低。(3)簡便安全操作簡單、安全、自動化程度高而且防止污染。擴增和檢測可以在同一管內(nèi)檢測，不需要開蓋，不易被污染；同時擴增和檢測一步完成，不需要后期處理，無需要擔(dān)心放射性污染。(4)全程監(jiān)控本專利技術(shù)實施例提供的試劑盒引入了內(nèi)部陽性控制質(zhì)量控制體系，對檢測過程進行全程質(zhì)量監(jiān)控，有效避免假陽性或者假陰性。(5)快速速度快、高通量，可在3-4小時完成。本專利技術(shù)的試劑盒能快速、準(zhǔn)確、定量檢測MPL基因W515L位點突變和MPL基因4W515K位點突變水平，有效杜絕了假陽性和假陰性的發(fā)生，用于骨髓增殖性腫瘤的診斷及治療過程中微小殘留病的監(jiān)測，為骨髓增殖性腫瘤的診斷、制定治療方案及療效評價和預(yù)后提供了重要的檢測手段。附圖說明為了更清楚地說明本專利技術(shù)實施例中的技術(shù)方案，下面將對實施例描述中所需要使·用的附圖作簡單地本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護點】
一種檢測MPL基因W515位點突變的試劑盒，包括檢測用引物、熒光探針、熒光定量PCR混合液、陰性對照和陽性對照，其特征在于，所述檢測用引物、熒光探針包括MPL基因W515L位點突變特異性引物和MPL基因W515K位點突變特異性引物中的至少一種和內(nèi)參基因ABL引物及Taqman熒光探針，其中：MPL基因W515L位點突變特異性上游引物序列如序列表中SEQ？ID？NO:1所示；MPL基因W515L位點突變特異性下游引物序列如序列表中SEQ？ID？NO:2所示；MPL基因W515L位點突變特異性Taqman熒光探針如序列表中SEQ？ID？NO:3所示；MPL基因W515K位點突變特異性上游引物序列如序列表中SEQ？ID？NO:4所示；MPL基因W515K位點突變特異性下游引物序列如序列表中SEQ？ID？NO:5所示；MPL基因W515K位點突變特異性Taqman熒光探針如序列表中SEQ？ID？NO:6所示；ABL基因上游引物序列如序列表中SEQ？ID？NO:7所示；ABL基因下游引物序列如序列表中SEQ？ID？NO:8所示；ABL基因Taqman熒光探針如序列表中SEQ？ID？NO:9所示？。...
【技術(shù)特征摘要】
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：童永清，李艷，
申請(專利權(quán))人：童永清，李艷，
類型：發(fā)明
國別省市：
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