本發明專利技術公開了登革病毒2型NS3蛋白的表位多肽，該表位肽的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示，具有特異性高，免疫原性好的優點，該表位多肽可以直接與載體蛋白偶聯形成交聯體，制成表位多肽的衍生物，制得的衍生物能夠制備預防登革病毒2型感染的疫苗，安全、可靠，無毒副作用，對預防和治療登革病毒2型感染奠定了基礎。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及醫藥領域，特別涉及登革病毒2型NS3蛋白的表位多肽，還涉及該表位多肽的衍生物和應用。
技術介紹
登革病毒(denguevirus, DV)是引起人類登革熱(classical dengue fever,DF)、登革出血熱(dengue hemorrhagic fever, DHF)和登革休克綜合征(dengue shocksyndrome,DSS)的病原體。近年來，隨著人口流動的增加及全球氣侯變暖，每年熱帶和亞熱帶地區約有I億人受到該病毒的感染，其中DHF/DSS患者約為50萬人，病死率高達5%，如未得到及時治療，病死率可上升至50%。近年來，在流行地區，DHF/DSS的發病率呈明顯增加趨勢，已成為嚴重的公共衛生問題。但迄今為止，DF、DHF和DSS的發病機制仍不十分清楚，也缺乏安全有效的預防疫苗和治療藥物。因此，DF、DHF和DSS已成為當今世界嚴重的公共 衛生問題，對其病原體、發病機理及防治策略的相關研究具有重要意義。DV是黃病毒屬的單鏈正股RNA病毒，基因組約為10kb、含有一個0RF，編碼3個結構蛋白(C，prM和E)和7個非結構蛋白(NSl-NS2a/2b-NS3-NS4a/4b-NS5)。DV有四個血清型(DV1-DV4)，以蚊蟲為傳播媒介，其中主要流行的是DV2。目前，DV致病機理和人體免疫防御機制不明，缺乏有效的治療手段，臨床上仍以治療為主。由于人體抵抗不同型DV感染的能力弱，發病地區的人群反復感染DV是比較常見的，因而潛在的DHF/DSS發生的可能性很大，導致DV的危害性呈上升趨勢。DV致病機理和人體免疫防御機制不明使得DV的疫苗研究仍處在實驗階段。DV疫苗研究的重點集中在研制四價疫苗，希望獲得能同時針對四型DV的疫苗，從而在根本上防治DV感染和DHF/DSS的出現。減毒四價活疫苗曾一度被認為是最具前景的候選疫苗。但由于是減毒或滅活病原體，存在一定的毒副作用?；蚬こ桃呙缪芯侩m然取得了較大進步，獲得了各種重組的DV蛋白。但無論是大腸桿菌還是真核體系的酵母菌、桿狀病毒、哺乳動物細胞等表達方式均有不足，且重組蛋白純化復雜，避免蛋白結構和功能改變困難。迄今為止，仍然沒有獲得既安全又有效的疫苗。20世紀80年代初，Lerner等提出發展合成多肽疫苗，并預測合成多肽疫苗將是人類預防疾病的終極武器。合成肽疫苗(synthetic peptide vaccine)就是用化學合成抗原表位氨基酸序列法制備而成的具有保護性作用的類似天然抗原決定簇的多肽疫苗。多肽具有免疫背景明確、穩定、純度高、易于獲得、批間差異極小、無毒副作用等優點，還有一個極大的優勢就在于可對任意氨基酸順序組合進行合成，可以極方便地將多種病原的表位、同類病原不同亞型的表位組合在一起，從而獲得針對多種疾病的超級疫苗。這種疫苗不含核酸，是最為理想的安全新型疫苗，也是目前研制預防和控制感染性疾病和惡性腫瘤的新型疫苗的主要方向之一。對于合成肽疫苗的設計，最重要的一步是找到特異的抗原表位。登革病毒的非結構蛋白3(NS3)是一個多功能蛋白，具有多種酶活性，涉及到病毒多聚蛋白的加工和RNA的復制及5’加帽。該蛋白具有很好的免疫原性，并存在特異的CD4+和CD8+ T細胞識別表位?？烧T導機體產生特異性的體液免疫和細胞免疫反應。因此，急需一種登革病毒2型NS3蛋白的表位肽，特異性高、免疫原性好。
技術實現思路
有鑒于此，本專利技術的目的之一在于提供一個登革病毒2型NS3蛋白的表位多肽；本專利技術的目的之二在于提供一個含登革病毒2型NS3蛋白的表位多肽的衍生物，本專利技術的目的之三在于提供衍生物在制備預防或治療登革病毒2型感染的藥物中的應用。本專利技術的目的之四在于提供衍生物在制備診斷或檢測登革病毒2型感染的試劑中的應用。為實現上述專利技術目的，技術方案為 I.登革病毒2型NS3蛋白的表位多肽，所述表位多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO. I所/Jn ο2.含權利要求I所述表位多肽的衍生物，所述衍生物為所述表位多肽與載體蛋白·偶聯的交聯體。優選的，所述載體蛋白為牛血清白蛋白。3.所述的衍生物在制備預防或治療登革病毒2型感染的疫苗中的應用。4.所述的衍生物在制備診斷或檢測登革病毒2型感染的試劑中的應用。本專利技術有益效果在于本專利技術公開了登革病毒2型NS3蛋白的表位多肽，是以抗登革病毒NS3蛋白單克隆4F5抗體為基礎，以噬菌體肽庫初步確定單克隆4F5抗體所對應的抗原表位所在區域，然后合成表位多肽，通過拮抗試驗，檢測到表位多肽能夠抑制單克隆4F5抗體結合登革病毒2型抗原的活性。為了增強表位多肽的免疫原性，將表位多肽與載體蛋白偶聯形成交聯體，免疫BALB/c小鼠后能產生特異的免疫反應，因此可以利用表位多肽研制登革病毒2型的疫苗和診斷試劑。附圖說明為了使本專利技術的目的、技術方案和優點更加清楚，下面將結合附圖對本專利技術作進一步的詳細描述，其中 圖I篩選的噬菌體與抗體4F5的結合能力鑒定結果圖(4F5為單克隆抗體，匪S為正常鼠血清)。圖2篩選噬菌體肽庫的氨基酸序列及登革病毒2型(Trl751株)所對應的序列。圖3 4F5與表位多肽反應的ELISA結果圖。圖4表位多肽的拮抗試驗ELISA結果圖。圖5表位多肽與BSA偶聯的交聯體免疫動物后抗血清效價測定圖。圖6抗交聯體血清與DV2的免疫熒光分析結果圖(a: DV2感染的細胞與表位多肽免疫的抗血清孵育；b:正常細胞與表位多肽免疫的抗血清孵育；c: DV2感染的細胞與對照多肽免疫的抗血清孵育；d:正常細胞與對照多肽免疫的抗血清孵育)。具體實施例方式為了使本專利技術的目的、技術方案和優點更加清楚，下面對本專利技術的優選實施例進行詳細的描述。以下將參照附圖，對本專利技術的優選實施例進行詳細描述。優選實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，或按照制造廠商所建議的條件進行。實施例I、材料的準備 登革病毒2型(DV2，Trl751株)由本實驗室保存。實驗動物BALB/c小鼠，6-8周齡，SPF級，雌性，體重18_22g，購自第三軍醫大學實驗動物中心。合成多肽由上海生工生物工程公司合成，用二甲亞砜(DMSO)溶解成5mg/mL的濃度，_70°C保存，臨用時用磷酸鹽緩沖液(PBS)稀釋成lmg/mL。弗氏佐劑、弗氏不完全佐劑購自美國Sigma公司；噬菌體肽庫展示試劑盒(Ph.D. -7 Phage Display Peptide Library Kit),購自美國 NEB 公司。LB液體培養基胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCllOg加蒸餾水至IOOOmL,調整pH至7. 4,高壓蒸氣滅菌。LB固體培養基1. 5g瓊脂粉加入IOOmL LB培養液中，高壓蒸氣滅菌后傾倒平板。DNA 電泳緩沖液(50XTAE) Tris 242g，冰乙酸 57. lml, Na2EDTA · 2H20 37. 2g，力口水至IOOOmL即可，應用濃度為1XTAE。EB溶液EB貯存液(10mg/ml)，O. 2g EB溶解于20mL H2O中，混勻后于4°C避光保存。EB染色液10 μ L EB貯存液，IOOmL I X TAE緩沖液。PBS 緩沖液(pH7. 2) =Na2HPO4 14mmol, NaH2P046mmoI，NaCl2 9g，加蒸本文檔來自技高網...
【技術保護點】
登革病毒2型NS3蛋白的表位多肽，其特征在于：所述表位多肽的氨基酸序列如SEQ？ID？NO.1所示。
【技術特征摘要】
【專利技術屬性】
技術研發人員：田衍平，陳宗濤，徐小峰，
申請(專利權)人：中國人民解放軍第三軍醫大學，
類型：發明
國別省市：
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