一種高純度云芝糖肽的制備方法及應用技術

本發明專利技術涉及一種高純度云芝糖肽的制備方法及應用。該方法通過對云芝糖肽粗粉進行提取純化，獲得了多糖和蛋白含量較高的云芝糖肽。本發明專利技術制備的云芝糖肽能夠提高雞的抗體水平，從而可提高雞群的免疫力，可用于制備具有免疫或/和生理調節活性的人藥或獸藥，尤其可以作為畜禽疫苗免疫增強劑。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及獸用或人用藥品生產
，特別涉及一種高純度云芝糖肽的制備方法及制藥用途。
技術介紹
細菌及病毒性傳染病是危害畜牧業生產的大敵，隨著畜牧業日趨集約化，傳染病的預防顯得更加重要。對于病毒性疾病，如何選擇合適的藥物治療一直是令養殖者頭疼的問題，同時病毒性疾病的藥物治療又很難奏效，必須進行免疫接種加以預防。但在生產過程中，動物的免疫失敗現象又經常發生，如疫苗運輸、保存不當、免疫程序不合理、接種方法有誤、劑量不準如接種劑量過多或過少等，導致動物免疫失敗，暴發傳染性疾病。目前，畜禽養殖業中廣泛應用的疫(菌)苗佐劑如鋁膠鹽水、油佐劑等，由于這些產品在活性、粘滯性、穩 定性等方面存在著一定缺陷，使得某些疫(菌)苗存在著保護率低、免疫預防效果不佳等問題。因此，為提高畜禽疫(菌)苗的免疫保護力，延長免疫持續期，適應純化疫苗、亞單位疫苗及合成肽疫苗的發展，研制開發可生物代謝、無毒害、活性強的免疫調節劑或增強劑作為疫(菌)苗佐劑已成為迫切需要解決的問題和當前佐劑研究的一個重要方向。免疫增強劑能提高動物自身免疫力，解除動物免疫抑制，增強動物對細菌和病毒性傳染病的抵抗力。因此免疫增強劑在動物生產中的研究與應用日益引起國內外學者的高度重視。免疫增強劑也稱免疫佐劑，是通過不同的作用方式，如增強巨噬細胞活性，增強抗原物質的免疫原性和穩定性，促進抗體的合成與分泌等，從而增強動物機體非特異性和特異性免疫的物質。隨著科學技術的進步及獸醫學技術的提高，選擇一種特征確定、高效、穩定、毒副作用小的理想免疫增強劑將是未來抗御疾病的主要途徑和手段。目前，已研究的免疫增強劑種類非常多，根據其來源，可以分為產物和化學合成物兩大類，進一步可細分為生理活性產物、微生物來源物質、合成化學物、中草藥等。屬于微生物及其組分的有結核桿菌、雙歧桿菌以及酵母多糖、細菌脂多糖、分支桿菌細胞壁及其亞單位胞壁酰二肽等；屬于生理活性產物的有胸腺因子、細胞因子、轉移因子等；屬于化學合成的有左旋咪唑、多聚核苷酸、表面活性分子及人工合成的多種酯類；屬于中草藥的如黃芪、刺五加等以及中草藥提取物如多糖、生物堿、有機酸和多種甙類物質，如黃芪多糖、小檗堿、人參皂甙等。目前的國內外文獻中，關于云芝糖肽的研究很多，對于云芝糖肽的提取和應用也有許多報道，但卻缺少一種高純度云芝糖肽的提取純化工藝，也沒有將其作為畜禽疫苗免疫增強劑的報道。
技術實現思路
鑒于現有技術的不足，本專利技術的目在于通過對云芝糖肽的提取純化工藝和體內外活性進行研究，提供一種高純度云芝糖肽的制備方法及制藥用途。本專利技術的目的是這樣實現的一種高純度云芝糖肽的制備方法，包括如下步驟(I)取云芝糖肽粗粉，按料水比I :35-60加入5-8% (w/v) NaHCO3溶液，加熱至70-720C，保溫浸提I. 5-2. 5h，5000-6000rpm離心，取上清液，80°C以下加熱濃縮8_10倍，再加入5-7倍體積的無水乙醇，在1-5°C的環境下靜置18-36h后，4000-5000rpm離心，棄上清液，沉淀先后用95%乙醇、無水乙醇、丙酮、乙醚分別洗滌1-3次，烘干得云芝糖肽半成品；(2)取云芝糖肽半成品，加雙蒸水溶解，再加入O. 2-0. 3倍體積的有機溶劑，所述的有機溶劑為體積比=5 1的氯仿和正丁醇，劇烈振蕩混勻15-30min,4000-5000rpm離心，取上清液，重復2次，合并上清液裝入O. 20-0. 30 μ m透析膜內，流水透析36_60h，蒸餾水透析18-30h，60°C以下加熱濃縮后，加入3-5倍體積的無水乙醇充分振蕩于1-5°C的環境下靜置18-36h后，棄上清，沉淀先后以無水乙醇、丙酮洗滌，烘干得云芝糖肽成品。優選地，所述高純度云芝糖肽的制備方法，其中步驟(I)為取云芝糖肽粗粉， 按料水比I =45-50加入6% (w/v) NaHCO3溶液，加熱至70-72 °C，保溫浸提I. 5-2. 5h，5000-6000rpm離心，取上清液，80°C以下加熱濃縮9倍，再加入6倍體積的無水乙醇，在1-3°C的環境下靜置18-36h后，4000-5000rpm離心，棄上清液，沉淀先后用95%乙醇、無水乙醇、丙酮、乙醚分別洗滌2次，烘干得云芝糖肽半成品。優選地，所述高純度云芝糖肽的制備方法，其中步驟(2)為取云芝糖肽半成品，加雙蒸水溶解，再加入O. 2-0. 3倍體積的有機溶劑，所述的有機溶劑為體積比=5 1的氯仿和正丁醇，劇烈振蕩混勻15-30min，4000-5000rpm離心，取上清液，重復2次，合并上清液裝入O. 22 μ m透析膜內，流水透析40-48h，蒸餾水透析18_30h，60°C以下加熱濃縮后，加入4倍體積的無水乙醇充分振蕩于1_3°C的環境下靜置24-30h后，棄上清，沉淀先后以無水乙醇、丙酮分別洗滌2次，烘干得云芝糖肽成品。通過體外試驗研究，本專利技術制備的云芝糖肽能夠提高雞的抗體水平，從而可提高雞群的免疫力。因此，本專利技術第二個目的在于提供上述方法制備的云芝糖肽在制備具有免疫或/和生理調節活性的藥品中的應用。優選地，所述的藥品為獸藥、人用藥品。進一步優選地，所述的獸藥為畜禽疫苗免疫增強劑。與現有技術相比，本專利技術涉及的高純度云芝糖肽制備方法具有如下優點和顯著進I K少(I)多糖和蛋白含量高。實施例1-3制備出的云芝糖肽經檢測，其多糖含量達到61%以上，蛋白含量達到9. 7%以上。相比云芝糖肽粗粉，多糖含量和蛋白含量顯著提高(見表 1-3)。(2)云芝糖肽可提高雞群的免疫力。由實施例4的表4可見，對于免疫雞，不同處理對雞的發病率則有一定改善作用，對照組雞發病率為27. 2%，而云芝糖肽飲水處理組雞的發病率為4. 5%，降低了 22. 7%。這說明云芝糖肽能夠提高雞的抗體水平，從而提高雞的免疫水平，減少發病率。而且，對于發病后雞的死亡率，云芝糖肽達到了較為顯著的改善作用。具體實施例方式以下是本專利技術的具體制備例，對本專利技術的技術方案做進一步作描述，但是本專利技術的保護范圍并不限于這些實施例。凡是不背離本專利技術構思的改變或等同替代均包括在本專利技術的保護范圍之內。實施例I云芝糖肽的提取純化取云芝糖肽粗粉lkg，按料水比I :48加入6%(w/v)NaHC0jK溶液，加熱至70_72°C，保溫浸提2h，5500rpm離心，取上清液，加熱至75°C保溫濃縮9倍，再加入6倍體積的無水乙醇，在1_3°C的環境下靜置24h后，4500rpm離心，棄上清液，沉淀先后用95%乙醇、無水乙醇、丙酮、乙醚分別洗漆2次(4000rpm, 5min),烘干得492. 5g云芝糖肽半成品。取500g云芝糖肽半成品，加雙蒸水溶解，再加入O. 25倍體積的有機溶劑，所述的有機溶劑為體積比=5 1的氯仿和正丁醇，劇烈振蕩混勻20min,4500rpm離心IOmin,取上清液，重復2次，合并上清液裝入O. 22 μ m透析膜內，流水透析45h，蒸餾水透析24h，加熱至58°C濃縮后，加入4倍體積的無水乙醇充分振蕩于1_3°C的環境下靜置24h后，棄上清，沉淀先后以無水乙醇、丙酮分別洗漆2次(4000rpm, 5min),烘干得141. 3g云芝糖肽成品。 通過對樣品的多糖和蛋白含量檢測發現，經過純化可以使得云芝糖肽的多糖含量提高43. 0本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種高純度云芝糖肽的制備方法，包括如下步驟：（1）取云芝糖肽粗粉，按料水比1：35?60加入5?8%（w/v）NaHCO3溶液，加熱至70?72℃，保溫浸提1.5?2.5h，5000?6000rpm離心，取上清液，80℃以下加熱濃縮8?10倍，再加入5?7倍體積的無水乙醇，在1?5℃的環境下靜置18?36h后，4000?5000rpm離心，棄上清液，沉淀先后用95%乙醇、無水乙醇、丙酮、乙醚分別洗滌1?3次，烘干得云芝糖肽半成品；（2）取云芝糖肽半成品，加雙蒸水溶解，再加入0.2?0.3倍體積的有機溶劑，所述的有機溶劑為體積比=5：1的氯仿和正丁醇，劇烈振蕩混勻15?30min，4000?5000rpm離心，取上清液，重復2次，合并上清液裝入0.20?0.30μm透析膜內，流水透析36?60h，蒸餾水透析18?30h，60℃以下加熱濃縮后，加入3?5倍體積的無水乙醇充分振蕩于1?5℃的環境下靜置18?36h后，棄上清，沉淀先后以無水乙醇、丙酮洗滌，烘干得云芝糖肽成品。

【技術特征摘要】

【專利技術屬性】
技術研發人員：任麗，孟懷旺，
申請(專利權)人：重慶優寶生物技術有限公司，
類型：發明
國別省市：