本發明專利技術公開了具有腫瘤細胞殺傷活性的端粒蛋白多肽片段及其應用。本發明專利技術所提供的多肽是如下（a）或（b）：（a）由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的多肽；（b）將序列1的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與腫瘤細胞殺傷活性相關的由序列1衍生的多肽。實驗證明，表達本發明專利技術所提供多肽的重組腺病毒能夠抑制端粒酶陽性的腫瘤細胞生長，誘導腫瘤細胞凋亡，抑制腫瘤體內外生長。這表明本發明專利技術的多肽具有廣譜、特異性端粒酶陽性腫瘤細胞殺傷活性，同時該多肽對正常人體細胞的生長和生存沒有影響。這將對新型廣譜特異性抗腫瘤藥物的研發具有重要意義。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及具有腫瘤細胞殺傷活性的端粒蛋白多肽片段及其應用。
技術介紹
端粒是細胞染色體末端標志，由端粒DNA和端粒蛋白組成。端粒蛋白包括Potl、TPPl、Tin2、TRFl、TRF2和RAPl。這六種蛋白在端粒DNA上相互作用，形成多種形式端粒蛋白復合體，對保護端粒DNA不被細胞錯誤識別為染色體損傷斷端和引發染色體末端DNA損傷反應有重要作用。端粒蛋白復合體的功能性結構受端粒DNA序列長度調控。人體正常細胞由于缺乏端粒酶活性，端粒DNA長度隨細胞分裂次數增多而發生逐漸縮短，最終導致端粒蛋白復合體功能性結構喪失，引發細胞染色體末端DNA損傷反應,誘導細胞衰老或凋亡。因此人體正常細胞只具備有限次數的分裂倍增能力，不能無限繁殖。相反，阻斷端粒DNA隨細胞分裂而縮短的趨勢，獲得永久性端粒蛋白染色體末端保護能力，是所有人類細胞癌變 的一個重要步驟，是腫瘤細胞形成永生化惡性生長能力的共同基礎。大量研究已經證明誘導端粒蛋白復合體功能障礙具有廣譜、完全的腫瘤抑制效應，是治療人類腫瘤性疾病的一條潛在途徑。但關鍵問題是尋找出能夠特異性攻擊腫瘤細胞的端粒蛋白復合體而不影響正常細胞端粒蛋白復合體的結構和功能的治療靶標和藥物。在已經鑒定出的六種端粒組成型結構蛋白中，Potl是主要用于抑制ATR在端粒上介導的單鏈DNA損傷反應活化的專業化端粒保護性蛋白(Drik H, et al. Telomereprotection by mammalian Potl requires interaction with TppLNat struct. Mol.Biol. 14(2007) :754-761.以及 Zimmerman S，UM Martens. Telomeres and telomerase astargets for cancer therapy. Cell Mol Life Sci 2007 (64) :906-21. ) 全長 Potl 蛋白由634個氨基酸組成，分為兩個主要功能結構域，一是N-端OB fold結構域與端粒單鏈DNA的特異高親和力結合；另一個是C-端與另一種端粒結構蛋白TPPl結合結構域。Potl與TPPl相互作用是介導Potl端粒定位的主要機制。但有關Potl在端粒上如何抑制ATR的作用機制并不清楚。以往研究發現去除Potl N端的OB fold結構域并不影響剩余的Potl片段(Potlaal21-634)在細胞中的端粒定位，同時在腫瘤細胞中表達Potlaal21_634片段能促進端粒酶延長端粒DNA和穩定腫瘤細胞端粒的效應。
技術實現思路
本專利技術的目的是提供一種具有廣譜特異腫瘤細胞殺傷活性的端粒蛋白多肽片段及其應用。本專利技術所提供的多肽，名稱為PotlClOO，由Potl蛋白C-末端的114個氨基酸殘基組成,具體來說，PotlClOO是如下(a)或(b)(a)由序列表中序列I所示的氨基酸序列組成的多肽；(b)將序列I的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與腫瘤細胞殺傷活性相關的由序列I衍生的多肽。由所述多肽PotlClOO衍生的蛋白質也屬于本專利技術的保護范圍。在本專利技術中，所述蛋白質具體為由序列表中序列4所示氨基酸序列組成的蛋白質。該蛋白質，是在所述多肽PoticiOO的N端連接上綠色熒光蛋白(EGFP)后所形成的融合蛋白(命名為EGFP-Pot 1C100 )。其中，序列I由114個氨基酸組成；序列4由355個氨基酸組成，其中第242-355位對應序列I。編碼所述多肽PotlClOO或所述融合蛋白EGFP-PotlClOO的核酸分子也屬于本專利技術的保護范圍。所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因組DNA或重組DNA ;所述核酸分子也可以是 RNA，如 mRNA、hnRNA 或 tRNA 等。在本專利技術的一個實施例中，所述核酸分子具體為編碼所述多肽的基因(命名為·PotlClOO)或編碼所述融合蛋白EGFP-PotlClOO的基因(命名為EGFP-PotlClOO);所述基因是如下I) -4)中任一所述的DNA分子I)編碼序列為序列表中序列2的DNA分子；2)序列表中序列2所示的DNA分子；3)編碼序列為序列表中序列5所示的DNA分子；4)序列表中序列5所示的DNA分子。其中，序列2由345個核苷酸組成，編碼序列表中序列I所示的多肽；序列5由1068個核苷酸組成，編碼序列表中序列4所示的蛋白質。序列5的第1-717位為EGFP蛋白的編碼基因(不含終止密碼子)，對應序列表中序列3，第718-723位為Bgl II的識別序列，第724-1068位為PotlClOO基因(不含起始密碼子)，對應序列表中序列2。含有上述核酸分子的重組載體、表達盒、重組細胞、重組菌或重組病毒也屬于本專利技術的保護范圍。所述重組載體可為重組表達載體，也可為重組克隆載體。在本專利技術中，所述重組表達載體中啟動所述EGFP-PotlC100基因或所述PotlClOO基因轉錄的啟動子具體為MCMV啟動子。更為具體的，所述重組表達載體可為在pDC316載體或pDC315載體的多克隆位點處插入所述EGFP-PotlC100基因或所述PotlClOO基因得到的重組質粒。在本專利技術的一個實施例中，所述重組表達載體具體為在pDC316載體的多克隆位點處插入所述PotlClOO基因以及EGFP蛋白的編碼基因得到的同時表達所述PotlClOO多肽和所述EGFP蛋白的重組質粒(命名為pDC316-EGFP-Pot 1C100)。其中，插入所述PotlClOO基因(不含起始密碼子)的多克隆位點具體為BlII和Sal I ;插入所述EGFP蛋白的編碼基因的多克隆位點具體為EcoR I和Bgl II。即所述重組表達載體具體為在PDC316載體的多克隆位點EcoR I和Sal I之間插入所述EGFP-PotlClOO基因(序列5)。所述表達盒由能夠啟動所述EGFP-PotlClOO基因或所述PotlClOO基因表達的啟動子，所述EGFP-PotlClOO基因或所述PotlClOO基因，以及轉錄終止序列組成。在本專利技術的一個實施例中，所述重組病毒具體為攜帶并表達所述EGFP-PotlClOO基因或所述PotlClOO基因的重組腺病毒。在本專利技術中，所述重組腺病毒是基于Ad-MAX包裝系統構建得到的，具體可按照包括如下步驟將所述重組表達載體(在PDC316載體或pDC315載體(與pDC316載體相比，僅多克隆位點存在差異)的多克隆位點處插入所述EGFP-PotlClOO基因或所述PotlClOO基因得到的重組質粒)與骨架質粒PBH Glox ΔΕ1, 3Cre共轉染腺病毒包裝細胞得到重組細胞甲；培養所述重組細胞甲，獲得所述重組腺病毒。在本專利技術的一個實施例中，所述重組表達載體具體為所述重組表達載體pDC316-EGFP-PotlC100 ;所述腺病毒包裝細胞具體為HEK293 細胞。當然，基于其他腺病毒包裝系統構建得到的表達所述PotlClOO多肽的重組腺病毒也屬于本專利技術的保護范圍。上述多肽，或核酸分子，或重組載體，或表達盒，或重組細胞，或重組菌，或重組病毒在制備下述任一產品中的應用也屬于本專利技術的保護范圍(I)誘導腫瘤細胞凋亡的產品；(2)抑制本文檔來自技高網...
【技術保護點】
多肽，是如下（a）或（b）：（a）由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的多肽；（b）將序列1的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與腫瘤細胞殺傷活性相關的由序列1衍生的多肽。
【技術特征摘要】
【專利技術屬性】
技術研發人員：黃君健，金蕊，白云秀，馬航航，徐曉玲，
申請(專利權)人：中國人民解放軍軍事醫學科學院生物工程研究所，
類型：發明
國別省市：
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