本發(fā)明專利技術(shù)提供了一種人載脂蛋白B100(ApoBl00)化學(xué)發(fā)光免疫分析測(cè)定試劑盒及其制備方法。特別地，本發(fā)明專利技術(shù)提供了一種特異性識(shí)別人ApoB100的單克隆抗體，產(chǎn)生該單克隆抗體的雜交瘤，以及使用該單克隆抗體檢測(cè)人ApoB100的高靈敏度的方法。本發(fā)明專利技術(shù)的試劑盒具有靈敏度高，檢測(cè)范圍寬，操作方便，同時(shí)生產(chǎn)成本低等特點(diǎn)。
【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
一種人載脂蛋白B1tw單克隆抗體及其化學(xué)發(fā)光免疫分析測(cè)定試劑盒
本專利技術(shù)涉及識(shí)別人載脂蛋白Β·(Αρ0 B100)的單克隆抗體，產(chǎn)生該單克隆抗體的雜交瘤，學(xué)發(fā)光免疫分析定量測(cè)定(CLIA)試劑盒及其制備方法，本專利技術(shù)屬于生物
技術(shù)介紹
心腦血管疾病是一種嚴(yán)重威脅人類，特別是50歲以上中老年人健康的常見(jiàn)病，全世界每年死于心腦血管疾病的人數(shù)高達(dá)1500萬(wàn)人，居各種死因首位。心腦血管疾病具有“發(fā)病率高、致殘率高、死亡率高、復(fù)發(fā)率高，并發(fā)癥多”即“四高一多”的特點(diǎn)，目前，我國(guó)心腦血管疾病患者已經(jīng)超過(guò)2. 7億人！每年死于心腦血管疾病近300萬(wàn)人，占我國(guó)每年總死亡病因的51%。而幸存下來(lái)的患者75%不同程度喪失勞動(dòng)能力，心腦血管疾病已成為人類 死亡病因最聞的頭號(hào)殺手！載脂蛋白B(Apolipoprotein B, Apo B)是血楽；脂蛋白中蛋白質(zhì)的一種，根據(jù)氨基酸組成和分布分為Β100、Β48、Β74、Β26和Β50五種亞型。載脂蛋白B100(Apo B100)是低密度脂蛋白(Low density lipoprotein, LDL)、中密度脂蛋白(Intermediated densitylipoprotein, IDL)和極低密度脂蛋白(Very low density lipoprotein, VLDL)顆粒上主要的載脂蛋白，由肝臟合成，含有4563個(gè)氨基酸殘基，分子量約為510KDa。ApoB作為動(dòng)脈硬化、冠心病等的危險(xiǎn)因子，其與動(dòng)脈粥樣硬化型心血管疾病之間有著密切關(guān)系，其功能之一是攜帶膽固醇，因此ApoB在血液中的含量可作為膽固醇等脂類的指標(biāo)。患有急性心肌梗死、心腦疾病患者、動(dòng)脈硬化癥、高脂血癥、糖尿病、慢性腎功能不全等疾病ApoB含量出現(xiàn)增高。Apo Biqq與載脂蛋白Al (Apolipoprotein Al)的比值(Apo B/ΑΙ)在臨床上是心腦血管疾病檢測(cè)的重要指標(biāo)，與心肌梗塞、缺血性中風(fēng)有緊密的聯(lián)系，是微蛋白尿、糖尿病和新陳代謝綜合癥的獨(dú)立風(fēng)險(xiǎn)因子。所以Apo B·水平的檢測(cè)對(duì)疾病的早期預(yù)測(cè)有一定的意義。目前在臨床實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)ApoB100的方法主要是放射免疫分析(RIA)、免疫比濁法和酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISA)，其中RIA必須用放射性元素標(biāo)記，檢測(cè)設(shè)備復(fù)雜昂貴，其放射性元素的半衰期短，不能長(zhǎng)期保存，檢測(cè)結(jié)果不穩(wěn)定，同時(shí)存在放射性污染也給實(shí)驗(yàn)操作人員帶來(lái)了傷害；酶免疫分析法靈敏度低，影響因素較多，易造成假陰性和假陽(yáng)性。本專利技術(shù)是在酶聯(lián)免疫分析的基礎(chǔ)上應(yīng)用酶催化發(fā)光底物，通過(guò)發(fā)光底物產(chǎn)生的光信號(hào)來(lái)代替酶聯(lián)免疫分析中的顯色底物，其靈敏度有很大的提高，本專利技術(shù)操作簡(jiǎn)便，適用性強(qiáng)，可同時(shí)大批量的檢測(cè)，成本低，更易在臨床診斷和實(shí)驗(yàn)室推廣使用。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
本專利技術(shù)的目地是建立一種簡(jiǎn)單且具高靈敏度的檢測(cè)ApoBicitl的方法。并將該方法應(yīng)用于人類心腦血管疾病的檢測(cè)。本專利技術(shù)獲得了能夠產(chǎn)生特異性識(shí)別ApoBicitl的單克隆抗體(mAb)的雜交瘤細(xì)胞株4-3-2與雜交瘤細(xì)胞株4-6-3，該細(xì)胞株已于2012年3月6日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，保藏地址是，中國(guó).武漢.武漢大學(xué)，保藏編號(hào)為CCTCC C201209與CCTCC C201210。此外，經(jīng)過(guò)鑒定，兩珠單克隆抗體分別識(shí)別ApoBltltl的兩個(gè)不同表位，通過(guò)4-3-2與4-6-3的結(jié)合建立了夾心酶聯(lián)免疫反應(yīng)方法，提供一種人載脂蛋白B·化學(xué)發(fā)光免疫分析測(cè)定試劑盒以及該試劑盒的制備方法。利用該試劑盒分析檢測(cè)靈敏度高、特異性強(qiáng)。其是一種高靈敏度及高通量的檢測(cè)系統(tǒng)。為達(dá)到上述目的，本專利技術(shù)采用如下技術(shù)方案I.單克隆抗體的制備方法，具體包括以下步驟(I)用蛋白量為50ug的人ApoBltltl與弗氏完全佐劑混合；經(jīng)15天后進(jìn)行第二次相同劑量與弗氏不完全佐劑混合免疫；再15天后進(jìn)行第三次相同劑量與弗氏完全佐劑混合免疫；10天后尾部取血用間接ELISA方法測(cè)血清滴度，用相同劑量的純抗原不加佐劑加強(qiáng)免疫；3天后取脾細(xì)胞進(jìn)行融合； (2)將免疫小白鼠脾細(xì)胞與小白鼠骨髓瘤細(xì)胞(SP2/0)按5-10 I的比例，用50% PEG作為融合劑融合；(3)用含HAT(次黃嘌呤、氨基蝶呤、胸腺嘧啶)的無(wú)血清培養(yǎng)基，在37°C，5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10天，常規(guī)間接ELISA方法篩選陽(yáng)性孔。(4)篩選出的特異性強(qiáng)陽(yáng)性孔用常規(guī)的有限稀釋法克隆，獲得單抗細(xì)胞株進(jìn)一步擴(kuò)大培養(yǎng)；(5)收集培養(yǎng)上清液。親和層析法純化單克隆抗體，即為可專一識(shí)別人ApoBicici的抗體；(6)檢測(cè)單克隆抗體的滴度，選取較好的一株進(jìn)行標(biāo)記(例如HRP)，并對(duì)標(biāo)記好的單克隆抗體進(jìn)行滴度測(cè)定；(7)標(biāo)記好的單克隆抗體與其他未標(biāo)記的單克隆抗體進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)ELISA反應(yīng)，選取沒(méi)有競(jìng)爭(zhēng)的一株進(jìn)行夾心ELISA反應(yīng)，確定最佳條件。2.人載脂蛋白B·化學(xué)發(fā)光免疫分析測(cè)定試劑盒的建立本專利技術(shù)的人載脂蛋白B·化學(xué)發(fā)光免疫分析測(cè)定試劑盒包括人載脂蛋白B·單克隆抗體包被的不透明聚苯乙烯板；人載脂蛋白B·系列標(biāo)準(zhǔn)品；酶標(biāo)記的人載脂蛋白Bltltl另一株單克隆抗體；酶作用的發(fā)光底物A液和B液；洗滌液等。本專利技術(shù)提供了一種制備上述試劑盒的方法，包括以下步驟(I)標(biāo)準(zhǔn)品的配制和濃度的校正將人載脂蛋白B·純品，加入標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液，配制一高濃度標(biāo)準(zhǔn)品濃液，采用逐低稀釋的方法稀釋到各濃度，配制成O、IO、40、100、300、600ng/ml的系列標(biāo)準(zhǔn)品，標(biāo)準(zhǔn)品用國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)校正。(2)包被采用O. 5mol/L，pH值為9. 5的碳酸鹽緩沖液與適當(dāng)濃度的人載脂蛋白B·單抗混合成抗體濃度是I μ g/mL包被液，以100 μ L/孔包被在不透明的聚苯乙烯板上，4°C孵育過(guò)夜；(3)洗板用PBS-T洗液洗板孔2次；(4)封閉封閉液包含NaCl 8g，KCl O. 2g，Na2HPO4 · 12H20 2. 9g，KH2PO4 0. 2g，蔗糖 20. 00g，proclin300 1.00ml, BSA 20. 00g，封閉液的 PH 值為 7. 3-7. 5，150 μ L/孔封閉，濕盒孵育2h ；(5)干燥去除封閉液，過(guò)夜干燥。(6)組裝為成品 將聚苯乙烯板子放入鋁箔袋中并放入干燥劑，密封保存。本專利技術(shù)的單克隆抗體可直接用于檢測(cè)樣品中的人ApoBicitl含量，通過(guò)大量培養(yǎng)單抗 細(xì)胞株，即可獲得大量的單克隆抗體，與多克隆抗體相比，具有純度高，專一性強(qiáng)、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)。本專利技術(shù)針對(duì)臨床實(shí)驗(yàn)室建立了一種既可以手工操作，又可以用于標(biāo)準(zhǔn)全自動(dòng)檢測(cè)儀器的檢測(cè)手段，建立了檢測(cè)人血清ApoBicitl的定量檢測(cè)方法。本專利技術(shù)的人載脂蛋白Bltltl定量檢測(cè)試劑盒(CLIA)可以專一的檢測(cè)出人血清中的ApoBicitl的含量，具有簡(jiǎn)便、快速、靈敏、穩(wěn)定的優(yōu)點(diǎn)。本專利技術(shù)的試劑盒，包被的抗體與酶標(biāo)記的抗體及被測(cè)樣品中的人載脂蛋白Bltltl形成“包被抗體-抗原-抗體-酶”的夾心復(fù)合物結(jié)構(gòu)，所以本專利技術(shù)采用的是“雙抗夾心法”的反應(yīng)模式。應(yīng)用酶催化發(fā)光底物，通過(guò)檢測(cè)發(fā)光底物產(chǎn)生的光信號(hào)代替酶聯(lián)免疫分析中的顯色底物，因而具有與酶聯(lián)免疫分析同等的特異性，而靈敏度大大提高，比現(xiàn)今的酶聯(lián)免疫吸附分析靈敏度提高約10倍，可為疾病的診斷提供更為特異、快速、可本文檔來(lái)自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種能產(chǎn)生特異性識(shí)別人ApoB100的單克隆抗體的雜交瘤，其保藏號(hào)分別為CCTCCC201209和CCTCC?C201210，分別命名為4?3?2和4?6?3。
【技術(shù)特征摘要】
...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：藍(lán)興國(guó)，李玉花，張曉磊，李春雷，馮玥，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：大慶麥伯康生物技術(shù)有限公司，東北林業(yè)大學(xué)大慶生物技術(shù)研究院，李玉花，
類型：發(fā)明
國(guó)別省市：
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