本發明專利技術涉及分子和細胞生物學和生物化學。一方面，本發明專利技術提供具有纖維素酶活性如內切葡聚糖酶、纖維二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶活性的多肽，編碼這些多肽的多核苷酸，以及制備和使用這些多核苷酸和多肽的方法。一方面，本發明專利技術涉及多肽纖維素酶活性，例如內切葡聚糖酶、纖維二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β-葡糖苷酶活性，包括熱穩定和耐熱的活性，以及編碼這些酶的多核苷酸，以及制備和使用這些多核苷酸和多肽的方法。本發明專利技術的多肽可以被用于各種藥物、農業、食物和飼料加工和工業環境中。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及分子和細胞生物學和生物化學。一方面，本專利技術提供具有纖維素酶活性一例如，內切葡聚糖酶、纖維二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β -葡糖苷酶活性一的多肽、編碼這些多肽的多核苷酸，以及制備和使用這些多核苷酸和多肽的方法。一方面，本 專利技術涉及具有纖維素酶活性例如內切葡聚糖酶、纖維二糖水解酶、甘露聚糖酶和/或β_葡糖苷酶活性——包括熱穩定的和耐熱的活性——的多肽，和編碼這些酶的多核苷酸，以及制備和使用這些多核苷酸和多肽。本專利技術的多肽可用于各種制藥、農業和工業環境中。
技術介紹
纖維素是地球上最豐富的可再生資源。它由重復單元是纖維二糖的β _1，4葡萄糖單元的線性鏈組成，纖維二糖是具有如圖5所示結構的葡萄糖二聚體。該高分子通過一組酶進行降解，包括隨機水解纖維素高分子的內切葡聚糖酶(EG)以及從纖維素除去末端纖維二糖殘基的纖維二糖水解酶(CBH)。纖維二糖和纖維寡糖被β -葡糖苷酶(BG)水解成葡萄糖。所有這三種酶對于纖維素完全分解成葡萄糖是必需的。對于這三種酶的每一種，存在行使相同功能的不同結構的變體。此外，除了不同結構變體外，已知真菌和細菌還產生多種形式的相同結構變體。已知一些厭氧細菌和真菌以多酶復合物的形式產生這些酶，這一事實進一步使該系統復雜化，所述多酶復合物含有都附著于酶支架上的多種酶，分子量在2百萬道爾頓以上。為什么這樣的酶復合系統對于這樣的簡單分子是必需的？ 一些研究者認為該復雜性原因在于底物的頑拗性質。纖維素鏈形成微纖維，其通過相鄰鏈的氫鍵鍵合堆積成晶體基質。該結構對于化學降解或酶促降解是高度耐受的。由于它們對纖維素的酶促攻擊性質，CBH被認為是該晶體纖維素降解中的關鍵酶。與CBH不同，EG具有開放的裂縫，其以垂直角度攻擊纖維素鏈。CBH通過含有活性位點的坑道直接攻擊所述鏈。目前認為，纖維素鏈進入所述坑道，同時，相鄰的氫鍵鍵合被破壞。一旦纖維二糖水解酶在該底物上建立起“立足點”，然后，EG可以進來，并更容易攻擊底物。已知的CBH的一個主要缺陷是其低的催化活性。一些觀點認為，低活性是源于如下事實來自水解的能量被轉化成動能，以破壞氫鍵并使酶能夠沿著底物移動。CBH是外切作用酶并在90個糖基水解酶家族中的6個家族中發現。它們包括家族5、6、7、9、10和48。家族5含有許多不同類型的糖基水解酶，包括纖維素酶、甘露聚糖酶和木聚糖酶。盡管在該家族中大部分纖維素酶是內切葡聚糖酶，仍存在纖維二糖水解酶的例子，最為人知的是來自熱纖梭菌(Clostridium thermocellum)的CelO。家族6僅含有內切葡聚糖酶或纖維二糖水解酶，其中纖維二糖水解酶成員比內切葡聚糖酶更多。該酶具有反向機制(invertingmechanism),并且晶體學研究表明,所述酶具有扭曲的α/β桶結構,其含有七個而非八個平行的β鏈。家族7酶也由內切葡聚糖酶和纖維二糖水解酶組成，其中纖維二糖水解酶更多，并且已知的成員僅來自真菌。該酶具有保持機構(retaining mechanism),并且晶體結構示出了膠凍卷結構。家族9含有內切葡聚糖酶、纖維二糖水解酶和β-葡糖苷酶，其中內切葡聚糖酶占優勢。然而，嗜熱放線菌(Thermobifida fusca)產生內切/外切_1，4_葡聚糖酶，其晶體結構顯示出(0/^)6桶狀折疊。該酶具有內切和外切葡聚糖酶CBH的特征。家族10僅含有2個成員，被描述為纖維二糖水解酶，其余主要被描述為木聚糖酶。家族10的纖維二糖水解酶和木聚糖酶具有對甲基-傘形基纖維二糖苷的活性。家族48主要含有細菌和厭氧真菌纖維二糖水解酶和內切葡聚糖酶。結構是類似于家族9的(α/α)6桶狀折疊。存在對用于公路車輛的較不昂貴和可再生的燃料來源的需求。如果新的燃料來源·在燃燒之后產生無害的終產物，則它們將更加有吸引力。乙醇提供了石油基燃料的有吸引力的可替代選擇，并且可以通過衍生自淀粉或木質纖維素的單體糖發酵獲得。然而，目前的經濟學不支持乙醇的廣泛使用，原因在于生產乙醇的高成本。一個目標在于降低成本的研究領域是增加用于從木質纖維素產生可發酵糖類的酶的技術效率。更有效地消化原料的酶的開發將轉變成降低的乙醇生產成本。更有效的工藝將降低美國對進口油的依賴以及與該依賴性相關的價格波動。使用更清潔的運輸燃料例如生物乙醇還可以降低凈CO2排放，其被認為是造成全球變暖的部分原因。 專利技術概述本專利技術提供了纖維素酶，例如，內切葡聚糖酶、纖維二糖水解酶和/或β -葡糖苷酶(多種β_葡糖苷酶)，以及制備和使用它們的方法。一方面，本專利技術的酶具有增加的催化速率，以改善底物水解過程。在催化速率上這種增加的效率導致在生產糖類上增加的效率，這可用于工業應用中，例如，如此產生的糖可被微生物用于乙醇生產。一方面，本專利技術提供了高活性(例如，具有增加的催化速率)的纖維二糖水解酶、內切葡聚糖酶和β -葡糖苷酶。本專利技術提供了工業應用(例如，生物物質(biomass)轉化為乙醇)，其利用了本專利技術的具有降低的酶成本的酶，例如，在生物物質轉化為乙醇的過程中降低的成本。因此，本專利技術提供了由任何生物質生產生物乙醇和含生物乙醇的組合物的有效率的工藝，所述含生物乙醇的組合物包括含有生物乙醇的燃料。一方面，本專利技術的酶具有葡聚糖酶例如內切葡聚糖酶活性，例如催化內部內-β-1，4-和/或β-1，3-葡聚糖鍵的水解。一方面，內切葡聚糖酶活性(例如，內切1,4-β -D-葡聚糖4-葡聚糖水解酶活性)包括水解纖維素、纖維素衍生物(例如羧甲基纖維素和羥乙基纖維素)地衣聚糖(Iichenin)中的1，4_和/或β _1，3-β-D-糖苷鍵、混合的β-1，3葡聚糖中的β-1，4鍵，例如谷類β-D-葡聚糖或木葡聚糖以及含有纖維質部分的其它植物材料。一方面，本專利技術的酶具有內切葡聚糖酶(例如，內切_β -1，4-葡聚糖酶，EC3.2.1.4;內切-β_1，3(1)-葡聚糖酶，EC 3. 2. 1.6;內切-β _1，3-葡聚糖酶，EC3. 2. I. 39)活性并且可以水解纖維素和葡聚糖中的內部0-1，4-和/或0-1，3-糖苷鍵，以產生較小分子量的葡萄糖和葡萄糖寡聚體。本專利技術提供了使用本專利技術的這些酶產生更小分子量的葡萄糖和葡萄糖寡聚體的方法。一方面，本專利技術的酶用于產生葡聚糖，例如，由1，4-β-和/或1,3-糖苷鍵接的D-吡喃葡糖形成的多糖。一方面，本專利技術的內切葡聚糖酶被用在食品工業中如烘焙及水果和蔬菜加工、農業廢物的分解、動物飼料的生產、紙漿和紙的生產、紡織物生產以及家用和工業清潔劑。一方面，通過微生物如真菌和/或細菌，生產本專利技術的酶，例如內切葡聚糖酶。一方面，本專利技術的酶如內切葡聚糖酶被用于水解葡聚糖，葡聚糖是谷物主要的非淀粉多糖。根據品種和生長條件，多糖的葡聚糖含量可顯著變化。該多糖的物理化學性質是在氧化條件下產生粘性溶液或者甚至是凝膠。此外，葡聚糖具有高的水結合能力。所有這些特征給幾個行業帶來了問題，包括釀造、烘焙、動物營養。在釀造應用中，葡聚糖的存在導致麥芽汁過濾性和形成渾濁的問題。在烘焙應用中(尤其對于曲奇和脆餅)，葡聚糖可產生發粘面團，其難以進行機械加工和減小餅干尺寸。因此，本專利技術的酶如內切葡聚糖酶被用于降低含β_葡聚糖的組合物中β_葡聚糖的量，例如，本專利技術的酶被用在降低溶液或 本文檔來自技高網...
【技術保護點】
分離的或重組的核酸，其包括(a)與如下序列在至少大約20、30、40、50、75、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1050、1100、1150或更多個殘基的區域內，具有至少50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高或完全的序列同一性的核酸序列：SEQ?ID?NO:1、SEQ?ID?NO:3、SEQ?ID?NO:5、SEQ?ID?NO:7、SEQ?ID?NO:9、SEQ?ID?NO:11、SEQ?ID?NO:13、SEQ?ID?NO:15、SEQ?ID?NO:17、SEQ?ID?NO:19、SEQ?ID?NO:21、SEQ?ID?NO:23、SEQ?ID?NO:25、SEQ?ID?NO:27、SEQ?ID?NO:29、SEQ?ID?NO:31、SEQ?ID?NO:33、SEQ?ID?NO:35、SEQ?ID?NO:37、SEQ?ID?NO:39、SEQ?ID?NO:41、SEQ?ID?NO:43、SEQ?ID?NO:45、SEQ?ID?NO:47、SEQ?ID?NO:49、SEQ?ID?NO:51、SEQ?ID?NO:53、SEQ?ID?NO:55、SEQ?ID?NO:57、SEQ?ID?NO:59、SEQ?ID?NO:61、SEQ?ID?NO:63、SEQ?ID?NO:65、SEQ?ID?NO:67、SEQ?ID?NO:69、SEQ?ID?NO:71、SEQ?ID?NO:73、SEQ?ID?NO:75、SEQ?ID?NO:77、SEQ?ID?NO:79、SEQ?ID?NO:81、SEQ?ID?NO:83、SEQ?ID?NO:85、SEQ?ID?NO:87、SEQ?ID?NO:89、SEQ?ID?NO:91、SEQ?ID?NO:93、SEQ?ID?NO:95、SEQ?ID?NO:97、SEQ?ID?NO:99、SEQ?ID?NO:101、SEQ?ID?NO:103、SEQ?ID?NO:105、SEQ?ID?NO:107、SEQ?ID?NO:109、SEQ?ID?NO:111、SEQ?ID?NO:113、SEQ?ID?NO:115、SEQ?ID?NO:117、SEQ?ID?NO:119、SEQ?ID?NO:121、SEQ?ID?NO.123、SEQ?ID?NO:125、SEQ?ID?NO:127、SEQ?ID?NO:129、SEQ?ID?NO:131、SEQ?ID?NO:133、SEQ?ID?NO:135、SEQ?ID?NO:137、SEQ?ID?NO:139、SEQ?ID?NO:141、SEQ?ID?NO:143、SEQ?ID?NO:145、SEQ?ID?NO:147、SEQ?ID?NO:149、SEQ?ID?NO:151、SEQ?ID?NO:153、SEQ?ID?NO:155、SEQ?ID?NO:157、SEQ?ID?NO:159、SEQ?ID?NO:161、SEQ?ID?NO:163或SEQ?ID?NO:165，其中所述核酸編碼至少一個具有纖維素酶活性的多肽，并且可選地，所述序列同一性通過運用了序列比較算法的分析或通過視覺觀察來確定；或(b)在嚴緊條件下與包含下列序列的核酸雜交的核酸序列：SEQ?ID?NO:1、SEQ?ID?NO:3、SEQ?ID?NO:5、SEQ?ID?NO:7、SEQ?ID?NO:9、SEQ?ID?NO:11、SEQ?ID?NO:13、SEQ?ID?NO:15、SEQ?ID?NO:17、SEQ?ID?NO:19、SEQ?ID?NO:21、SEQ?ID?NO:23、SEQ?ID?NO:25、SEQ?ID?NO:27、SEQ?ID?NO:29、SEQ?ID?NO:31、SEQ?ID?NO:33、SEQ?ID?NO:35、SEQ?ID?NO:37、SEQ?ID?NO:39、SEQ?ID?NO:41、SEQ?ID?NO:43、SEQ?ID?NO:45、SEQ?ID?NO:47、SEQ?ID?NO:49、SEQ?ID?NO:51、SEQ?ID...
【技術特征摘要】
...
【專利技術屬性】
技術研發人員：D·百隆，J·耿斯奇，M·迪凱科，
申請(專利權)人：維萊尼姆公司，
類型：發明
國別省市：
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