本發(fā)明專利技術(shù)提供了一種使用常見易培養(yǎng)的細胞系如RK13、ST、VeroE6、BHK-21、PK-15、IBRS-2等細胞系生產(chǎn)RHD病毒及疫苗的方法。該方法包括以下步驟：接種兔瘟病毒并進行吸附后，加入孵育劑進行細胞的孵育，并用細胞維持液培養(yǎng)細胞，獲得生產(chǎn)用兔瘟病毒種子；接種兔瘟病毒毒種吸附后，加入孵育劑進行細胞的孵育，重新加入細胞維持液培養(yǎng)細胞，獲得制苗用兔瘟病毒；加入滅活劑，滅活后加入獸藥學上可接受的疫苗佐劑制備為成品兔瘟疫苗。該方法使用培養(yǎng)病毒的細胞系是成熟的商業(yè)化的細胞系，具有生產(chǎn)工藝簡單穩(wěn)定、易操作，病毒含量高，批間差異小，質(zhì)量易控，可顯著提高疫苗產(chǎn)量和質(zhì)量。利用本發(fā)明專利技術(shù)生產(chǎn)的兔瘟疫苗安全性好、免疫力高，對兔瘟強毒攻擊具有完全的免疫保護作用。
【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)涉及一種用細胞系生產(chǎn)兔瘟疫苗的方法及其制品，屬于獸用疫苗領(lǐng)域。
技術(shù)介紹
兔病毒性出血癥(rabbit heamorrhagic disease, RHD)是1984年由我國首次發(fā)現(xiàn)并報道的新病毒病。由于其發(fā)病急、傳播快、發(fā)病率和死亡率都相當高，所以又俗稱“兔瘟”，是兔的一種以全身性出血和多發(fā)性血管內(nèi)凝血為主要癥狀的急性、烈性、病毒性傳染病。目前，國內(nèi)各省(市)均有流行。意大利、德國、法國、前捷克斯洛伐克、前蘇聯(lián)、西班牙、墨西哥、朝鮮和日本等國家也有發(fā)生。給全世界養(yǎng)兔業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失，國際獸醫(yī)局將該病列為B類傳染病，我國農(nóng)業(yè)部96號令頒布為二類疫病。RHD出現(xiàn)比較突然且流行速 度極快，現(xiàn)有研究結(jié)果表明世界范圍內(nèi)的所有RHDV分離株均為同一血清型，無論是遺傳特性還是抗原性都很穩(wěn)定。目前用兔病毒性出血癥組織滅活疫苗免疫是預防該病的主要措施，疫苗的制備過程中必須以RHDV感染致死的兔內(nèi)臟組織為原料。如中國專利CN88108859. 5公開了一種用病兔肝組織培養(yǎng)RHD病毒及生產(chǎn)兔瘟疫苗的方法，但該方法疫苗的制備過程中必須以RHDV感染致死的兔內(nèi)臟組織為原料，而用于制備組織滅活疫苗的非免疫兔的供應量卻很不穩(wěn)定，造成傳統(tǒng)的組織滅活疫苗的成本不斷增加，另外組織滅活疫苗存在散播強毒的潛在危險、批間差異大、產(chǎn)量不高等種種缺點。近年來，隨著兔產(chǎn)品等行業(yè)的興起以及其他動物疫苗等對家兔的需求的增加，市場對兔病毒性出血癥疫苗的需求量增加了許多，但是用于制備組織滅活疫苗的非免疫兔的供應量卻很不穩(wěn)定，造成傳統(tǒng)的組織滅活疫苗的成本不斷增加，加之組織滅活疫苗存在散播強毒的潛在危險、批間差異大、產(chǎn)量不高等種種缺點，組織滅活疫苗的廣泛應用受到一定的限制。
技術(shù)實現(xiàn)思路
有鑒于此，本專利技術(shù)的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)存在的不足之處，提供一種用細胞系生產(chǎn)兔瘟疫苗的方法，特別是使用常見易培養(yǎng)的細胞系如RK13、ST、VeroE6、BHK-21、PK-15、IBRS-2等細胞系生產(chǎn)RHD病毒及疫苗的方法。該方法使用培養(yǎng)病毒的細胞系是成熟的商業(yè)化的細胞系，具有生產(chǎn)工藝簡單穩(wěn)定、易操作，病毒含量高，批間差異小，質(zhì)量易控，可顯著提高疫苗產(chǎn)量和質(zhì)量。利用本專利技術(shù)生產(chǎn)的兔瘟疫苗安全性好、免疫力高，對兔瘟強毒攻擊具有完全的免疫保護作用。本專利技術(shù)的主要目的在于提供一種用細胞系生產(chǎn)兔瘟病毒的方法，包括以下步驟I)細胞的培養(yǎng)將細胞系經(jīng)消化傳代，以細胞培養(yǎng)液進行培養(yǎng)，形成生長良好的細胞單層；2)病毒接種與吸附將兔瘟病毒接種于上述生長良好的細胞單層，進行病毒吸附；3)細胞的孵育換用細胞維持液培養(yǎng)后，加入孵育劑進行細胞的孵育；4)病毒的繁殖將上述孵育劑洗去，重新加入細胞維持液培養(yǎng)細胞系以繁殖兔瘟病毒;5)病毒的收獲收獲含有兔瘟病毒的培養(yǎng)液。優(yōu)選地，本專利技術(shù)步驟2)中用于接種的兔瘟病毒為使用細胞系生產(chǎn)的兔瘟病毒。優(yōu)選地，本專利技術(shù)所述的細胞為RK13細胞、ST細胞、VeroE6細胞、BHK-21細胞、PK-15細胞、IBRS-2細胞的任意一種或幾種。優(yōu)選地，本專利技術(shù)所述的細胞系為RK13細胞。 優(yōu)選地，本專利技術(shù)所述的孵育劑為D-氨基葡萄糖、干擾素或脂多糖。優(yōu)選地，本專利技術(shù)所述的孵育時間為20-40分鐘；更優(yōu)選地，孵育時間為30分鐘。優(yōu)選地，本專利技術(shù)所述的細胞生長液為含血清的培養(yǎng)液，其中血清含量為1% -7%v/v ;更優(yōu)選地，所述細胞生長液的血清含量為5% _6%，最優(yōu)地，血清含量為6%。優(yōu)選地，本專利技術(shù)所述的細胞維持液為無血清的培養(yǎng)液。本專利技術(shù)的另一主要目的在于提供如上述的方法制備的兔瘟病毒，其中，使用細胞系生產(chǎn)兔瘟病毒。本專利技術(shù)的另一主要目的在于提供一種用細胞系生產(chǎn)兔瘟疫苗的方法使用上述方法生產(chǎn)的兔瘟病毒，加入滅活劑，滅活后加入獸藥學上可接受的疫苗佐劑制備為兔瘟疫苗。本專利技術(shù)的另一主要目的還在于提供一種用細胞系生產(chǎn)的兔瘟疫苗，其中，使用了細胞系用于生產(chǎn)兔瘟疫苗。由上可以看出，專利技術(shù)人意外地發(fā)現(xiàn)在兔瘟病毒繁殖時對細胞系進行細胞孵育可以幫助兔瘟病毒適應細胞系，特別是通過在生產(chǎn)用毒種和制苗用病毒中均使用孵育劑進行孵育，使得用細胞系繁殖兔瘟病毒成為了可能，從而實現(xiàn)了用細胞系生產(chǎn)兔瘟疫苗。而在現(xiàn)有技術(shù)中，國內(nèi)外無論使用RK13、ST、VeroE6、BHK-21、PK-15、IBRS-2等何種細胞系，或者使用同步培養(yǎng)、帶毒傳代、兔血清培養(yǎng)等方法，都沒有實現(xiàn)兔瘟病毒在細胞系中獲得有效的增殖,并達到利用細胞系生產(chǎn)兔瘟疫苗的目的。其次，專利技術(shù)人還發(fā)現(xiàn)在細胞的培養(yǎng)中使用低血清的細胞培養(yǎng)液，而在細胞的孵育和病毒的增殖中換用無血清的細胞維持液，可以幫助兔瘟病毒適應細胞系，促進病毒在細胞系的增殖，而在細胞生長階段又不影響良好細胞單層的形成。基于以上發(fā)現(xiàn)，本專利技術(shù)獲得了一種使用細胞系生產(chǎn)的兔瘟病毒及兔瘟疫苗，本專利技術(shù)的兔瘟疫苗至少有以下優(yōu)點I)用細胞系替代兔體組織制備兔瘟疫苗，可解決外源病原污染的問題，通過原材料和培養(yǎng)條件的嚴格控制，保證生產(chǎn)出來的疫苗純粹，確保疫苗的安全性；2)采用本專利技術(shù)的兔瘟病毒及兔瘟疫苗的生產(chǎn)方法，病毒的培養(yǎng)原料是較為廉價的細胞系，使用也比兔體組織更加方便；3)采用本專利技術(shù)培養(yǎng)的兔瘟細胞毒液病毒含量高，用高滴度的抗原制造的兔瘟疫苗可以大大提高疫苗的免疫力，經(jīng)免疫攻毒試驗結(jié)果顯示，對兔瘟強毒攻擊可100%保護；4)用細胞系生產(chǎn)兔瘟疫苗各批間質(zhì)量差異小，具有生產(chǎn)工藝穩(wěn)定、易操作、產(chǎn)量大、成本低等特點，具備工業(yè)化大生產(chǎn)的可行性和可放大性，具有很好的經(jīng)濟效益和應用前旦O5)用細胞系代替兔體組織制備兔瘟疫苗，可解決組織苗在注射過程中易引起兔體精神不振、減食、注射部位過敏紅腫等不良反應。具體實施例方式本專利技術(shù)實施例中使用了常見的商業(yè)化的容易培養(yǎng)的細胞系如RK13、ST、VeroE6、BHK-21、PK-15、IBRS-2等細胞系生產(chǎn)RHD病毒及疫苗，其他的哺乳動物細胞，也可以應用本專利技術(shù)的方法生產(chǎn)RHD病毒及疫苗。本專利技術(shù)實施例中接種用的兔瘟病毒優(yōu)選使用細胞系生產(chǎn)獲得的兔瘟病毒；但是使 用細胞系生產(chǎn)的接種用的兔瘟病毒的目的僅為了提高接種用的兔瘟病毒的效價和使得接種用的兔瘟病毒更適應在細胞中生長，獲得疫苗的效力更佳。因此，本專利技術(shù)的接種用兔瘟病毒并不限于使用經(jīng)細胞系培養(yǎng)的兔瘟病毒，其他來源的兔瘟病毒如組織來源的兔瘟病毒液也可以用于接種細胞系生產(chǎn)兔瘟病毒及疫苗。本專利技術(shù)的細胞培養(yǎng)液中血清為胎牛血清，其他的動物性血清如兔血清、羊血清等均可以作為細胞生長液，只要其血清含量比常規(guī)使用情況下的血清含量低，使得兔瘟病毒更容易適應在細胞中的生長，而又不影響細胞本身形成良好單層細胞即可。本專利技術(shù)的疫苗為滅活疫苗，也可以使兔瘟病毒進行弱化后，使用弱化病毒制備活疫苗，或使用基因工程方法獲得轉(zhuǎn)基因病毒，使用本專利技術(shù)的在動物細胞中培養(yǎng)方法制備滅活疫苗或活疫苗。為使本專利技術(shù)更加容易理解，下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本專利技術(shù)。應理解，這些實施例僅用于說明本專利技術(shù)而不用于限制本專利技術(shù)的范圍，下列實施例中未提及的具體實驗方法，通常按照常規(guī)實驗方法進行。實施例1RK13細胞生產(chǎn)兔瘟病毒與兔瘟疫苗I. RK13細胞生產(chǎn)兔瘟病毒與兔瘟疫苗的方法本實施例中，選擇兔腎細胞系RK13(購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所)作為生產(chǎn)兔瘟病毒與兔瘟疫苗的細胞系，兔瘟病毒AV33毒種購自中本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護點】
一種用細胞系生產(chǎn)兔瘟病毒的方法，其特征在于，包括以下步驟：1)細胞的培養(yǎng)：將細胞系經(jīng)消化傳代，以細胞培養(yǎng)液進行培養(yǎng)，形成生長良好的細胞單層；2)病毒接種與吸附：將兔瘟病毒接種于上述生長良好的細胞單層，進行病毒吸附；3)細胞的孵育：換用細胞維持液培養(yǎng)后，加入孵育劑進行細胞的孵育；4)病毒的繁殖：將上述孵育劑洗去，重新加入細胞維持液培養(yǎng)細胞系以繁殖兔瘟病毒；5)病毒的收獲：收獲含有兔瘟病毒的培養(yǎng)液。
【技術(shù)特征摘要】
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：張許科，孫進忠，白朝勇，
申請(專利權(quán))人：普萊柯生物工程股份有限公司，
類型：發(fā)明
國別省市：
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