本發明專利技術提供豬偽狂犬病毒、疫苗組合物及其應用，屬于生物技術領域。本發明專利技術的豬偽狂犬病毒PRV-JS株，其微生物保藏號是：CGMCCNO.6604。本發明專利技術還提供疫苗組合物，包括滅活的豬偽狂犬病毒PRV-JS株和獸藥學上可接受的佐劑。該疫苗組合物還包括獸藥學上可接受載體。本發明專利技術從各地豬場分離的豬偽狂犬病流行毒株中篩選出豬偽狂犬病毒PRV-JS株，該毒株具有良好的免疫原性，可作為滅活疫苗生產毒株及檢驗用毒種。本發明專利技術提供的疫苗組合物免疫后，豬產生的抗體水平較高，持續期長。采用本發明專利技術制備的疫苗組合物可用于預防豬偽狂犬病毒引起的母豬繁殖障礙、種豬不育癥及其它豬的偽狂犬病。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于生物
，具體涉及一株豬偽狂犬病毒、疫苗組合物及其應用。
技術介紹
豬偽狂犬病毒(Pseudorabies virus)屬于抱疫病毒科中抱疫病毒亞科豬抱疫病毒I型，能引起急性傳染的豬偽狂犬病(Aujeszky' s disease)。豬偽狂犬病在世界范圍內大流行，對全球的養豬業危害極大，造成巨大的經濟損失。豬發生偽狂犬病以后，其臨床癥狀取決于感染豬的年齡、病毒株的毒力、感染的劑量和途徑。成年豬一般呈隱性感染，懷孕母豬可導致流產、死胎、木乃伊和種豬不育等綜合癥候群。15日齡以內的仔豬發病死亡率可達100%，斷奶仔豬發病率40%，死亡率20%左右；對成年肥豬可引起生長停滯，增重緩慢等。目前本病被認為是威脅養豬生產和引起死亡的主要疾病之一。·疫苗接種是有效防制豬偽狂犬病最經濟、有效的方法。我國目前預防豬偽狂犬病的疫苗主要Bartha -K61株和BUK株等基因缺失弱毒活疫苗，弱毒疫苗免疫效果好沿用多年，至今在偽狂犬病的防制中仍起著重要作用。但是在實際生產中該病并沒有得到很好的控制，其中存在的問題引起疫苗研究者的重視。首先，弱毒疫苗可引起潛伏感染，并有散毒的危險，部分接種豬盡管血清中存在中和抗體，但排毒期仍可持續數年。其次，弱毒疫苗株在動物體內可能會與野毒或不同的基因缺失疫苗株之間發生基因重組從而變成強毒株成為新的傳染源。再次，未經充分致弱或過度致弱的疫苗株不僅不能誘導足夠的免疫保護反應，反而可能引起疾病及免疫抑制。對仔豬來說，其體內的母源抗體一定程度上影響了弱毒活疫苗的免疫效果。所以，豬偽狂犬滅活疫苗比弱毒疫苗能更有效地預防和控制偽狂犬病。但是，現有技術中存在的豬偽狂犬滅活疫苗的免疫效果、抗體持續期都不理想。
技術實現思路
本專利技術的目的是提供一株豬偽狂犬病毒PRV-JS株，該毒株對目前流行的豬偽狂犬病毒有很好的免疫原性。本專利技術的另一目的是提供一種疫苗組合物，該疫苗組合物免疫豬抗體水平較高，持續期長。本專利技術還提供豬偽狂犬病毒PRV-JS株在制備預防由豬偽狂犬病毒所致疾病藥物中的應用。本專利技術的目的采用如下技術方案實現 豬偽狂犬病毒PRV-JS株，其微生物保藏號是=CGMCC NO. 6604。豬偽狂犬病毒PRV-JS株的保藏信息如下 生物材料(株)=PRV-JS分類命名豬皰疹病毒I型 拉丁文學名Pseudorabies virus 保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)地址北京市朝陽區北辰西路I號院3號，中國科學院微生物研究所 保藏日期2012年9月24日 保藏編號CGMCC NO. 6604. 一種疫苗組合物，包括滅活的豬偽狂犬病毒PRV-JS株和獸藥學上可接受的佐劑。該疫苗組合物還包括獸藥學上可接受載體。所述疫苗組合物的制備方法，包括如下步驟 制備水相將吐溫-80與滅活的豬偽狂犬病毒PRV-JS株病毒液按體積比4 96混合均勻，得到水相； 制備油相將司本-80與注射用白油按照體積比為6 94混勻，得到油相； 乳化將油相和水相按照體積比為3 1混合并乳化，獲得所述疫苗組合物。 本專利技術還提供豬偽狂犬病毒PRV-JS株在制備預防由豬偽狂犬病毒所致疾病藥物中的應用。所述疾病為豬偽狂犬病毒引起的仔豬神經癥狀、母豬繁殖障礙及種豬不育癥。該疫苗組合物還包括獸藥學上可接受載體。本專利技術從各地豬場分離的豬偽狂犬病流行毒株中篩選出豬偽狂犬病毒PRV-JS株，該毒株具有良好的免疫原性，可作為滅活疫苗生產毒株及檢驗用毒種。本專利技術提供的疫苗組合物免疫后，豬產生的抗體水平較高，持續期長。采用本專利技術制備的疫苗組合物可用于預防豬偽狂犬病毒引起的母豬繁殖障礙、種豬不育癥及其它豬的偽狂犬病。附圖說明圖I接種了含毒材料的BHK21細胞的照片。圖2正常BHK21細胞的照片。圖3斷奶仔豬攻毒后的體溫變化。圖4是發病豬各組織PCR鑒定的電泳圖，其中泳道I-陰性對照，泳道2-腦，泳道3-淋巴，泳道4-肺，泳道5-腎，泳道6-脾，泳道7-2000 DNA Maker。圖5仔豬免疫豬偽狂犬病滅活疫苗后的ELISA抗體水平。圖6顯示攻毒后仔豬的體溫變化。圖7豬偽狂犬病滅活疫苗免疫后備母豬ELISA抗體消長規律。具體實施例方式實施例I豬偽狂犬病毒的獲得和特性測定 I.病毒分離 采集我國江蘇南京地區某一養豬場發病仔豬的脾、肺、腎、淋巴組織作為含毒材料。先將含毒材料無菌操作置于乳缽中，然后加入滅菌生理鹽水5ml，反復磨細；在每毫升處理過的含毒材料中加入青霉素200U和鏈霉素200U，混勻，將其放入-20 1冰箱內反復凍融3次，每次快凍快融以使病毒能從破碎的細胞中釋放出來；12000 r/min離心lOmin，取上清接種至BHK21細胞(購買自ATCC，即美國模式培養物集存庫)培養。培養2天后，與正常BHK21細胞(圖2)相比，含毒材料接種的BHK21細胞出現明顯拉網樣病變(圖I)。將培養物凍融2次后，獲得病毒液。2.病毒鑒定 提取本實施例標題I中所獲病毒液中的DNA，具體步驟如下取病毒液400 μ L，加入12. 5 μ L蛋白酶K和50 μ L、濃度為10%的SDS溶液，混勻，56°C作用30min ;依次加入200 μ L氯仿和200 μ L苯酚，劇烈振蕩15s，室溫放置5min ；4°C，12000轉離心IOmin ;取上清，加入等體積的氯仿混勻，室溫放置5min ；4°C, 12000轉離心IOmin ;取上清加入2倍體積的無水乙醇和I / 10體積、濃度為3M的乙酸鈉溶液，_20°C放置30min ；4°C, 12000轉離心IOmin ；棄上清，加入75%的乙醇1000 μ L洗滌；4°C，7500轉離心5min ;棄上清，干燥IOmin ;加入15 μ L雙蒸水溶解沉淀并作為模板進行PCR擴增。設計一對gE蛋白基因區域引物進行PCR鑒定，上游引物PRV-F (SEQ ID NO: I):CCCTGGACGCGAACGGCACGATG ;下游引物 PRV-R (SEQ ID NO:2): GGGTGGCACGCGGTCTCGAAGCA。PCR 擴增的反應體系(50ul):模板 5 μ L, GC Buffer 25 μ L, Mg2+ 3 μ L, dNTP2 μ L, PRV-F I μ L, PRV-R I μ L, Taq DNA 聚合酶 O. 5 μ L，H2O 12. 5 μ L。 PCR 反應程序94°C 預變性 5min ;進入循環94°C 60s，68°C 60s, 72°C 60s, 35個循環；72°C延伸IOmin。PCR擴增產物用1%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。將PCR擴增出的目的片段進行測序，結果顯示片段為850bp，具體序列如SEQ ID NO: 3所示。在NCBI進行BLAST分析，發現測序的片段與豬偽狂犬病毒基因相似率達到98%以上(結果見表1)，證明此毒株為豬偽狂犬病毒。表I目的片段序列分析比對序列號 [SII相似__￥_AY683136.I SuidherpesvirusIstrainSHglycoproteingl(US7)andglycoproteingE(US8)genes, partialcds99%AF171937.I Suidher本文檔來自技高網...
【技術保護點】
豬偽狂犬病毒PRV?JS株，其微生物保藏號是：CGMCC?NO.6604。
【技術特征摘要】
【專利技術屬性】
技術研發人員：唐波，張道華，張雪花，侯繼波，
申請(專利權)人：江蘇省農業科學院，
類型：發明
國別省市：
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