一種分離高鹽環(huán)境放線菌的培養(yǎng)基及其應(yīng)用制造技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)公開了一種分離高鹽環(huán)境放線菌的培養(yǎng)基及其應(yīng)用。培養(yǎng)基由甘露醇1%、丙氨酸0.1%、K2HPO4?0.1%、MgSO4?7H2O?0.1%、CaCO3?0.02%、FeSO4?7H2O?0.001%、Agar?1.8%、微量鹽0.0003%、復(fù)合維生素0.0004%、生物素0.000025%、重鉻酸鉀0.005%組成；微量鹽由FeSO4?7H2O、MnCl2?4H2O和ZnSO4?7H2O各0.0001%組成；復(fù)合維生素由B1、B2、B6、煙酸、肌醇、泛酸、對(duì)氨基苯甲酸、葉酸各0.00005%組成；該培養(yǎng)基適合高鹽、寡營(yíng)養(yǎng)的高鹽環(huán)境放線菌的分離，具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值。

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】

本專利技術(shù)涉及工業(yè)微生物
，具體的說，本專利技術(shù)具體涉及一種分離高鹽環(huán)境放線菌的培養(yǎng)基及其應(yīng)用的

技術(shù)介紹
現(xiàn)有技術(shù)認(rèn)為，用一般的分離方法從環(huán)境樣品中獲得的微生物純培養(yǎng)物重復(fù)性非常高，也很難再分離到新物種。尤其是放線菌，由于其產(chǎn)生多種具有生物活性的次級(jí)代謝產(chǎn)物而受到微生物學(xué)家的廣泛關(guān)注，但是目前用普通的分離方法篩選到的菌株大部分都是已知菌和常見菌，這給當(dāng)前活性物質(zhì)的篩選帶來了極大的困難。因此，探索有效的微生物分離方法，從不同角度、不同層次建立分離微生物的新方法就成了微生物領(lǐng)域長(zhǎng)期的研究任務(wù)和難點(diǎn)。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)放線菌分離方法的研究主要集中在樣品的預(yù)處理，抑制劑的選擇和培養(yǎng)基成分的改變等方面。對(duì)土壤樣品進(jìn)行預(yù)處理和加入抑制劑的主要目的是增加目的菌的數(shù)量，減少或抑制非目的菌的生長(zhǎng)。司美茹等研究發(fā)現(xiàn)，將土樣在120℃處理1h有利于放線菌孢子萌發(fā)，增加放線菌的種類和數(shù)量；75μg/ml的重鉻酸鉀和2μg/ml的青霉素配合使用可以使細(xì)菌的數(shù)量明顯減少而不影響放線菌的種類和數(shù)量。薛清等研究發(fā)現(xiàn)將土樣在120?W功率模式下微波輻照3min對(duì)提高放線菌的出菌率有促進(jìn)作用。姜怡等研究發(fā)現(xiàn)使用100?mg/L的放線菌酮和100?mg/L制霉菌素能有效抑制真菌而不影響放線菌的生長(zhǎng)。Li等使用極高頻輻射(extremely?high?frequency?radiation，EHF)與連續(xù)照射聯(lián)合使用的方法分離出了較多種類的稀有放線菌；Nonomura等使用6%的酵母提取物溶液處理樣品能分離到新的放線菌物種。Esther使用噬菌體作為指示物定向分離稀有放線菌；Hayakawa等以腐殖酸維生素培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，加入不同種類的抗生素，再結(jié)合不同的樣品前處理方法，分離出了小雙孢菌(Micromonospora)、野野村氏菌(Nonomuraea)、鏈孢囊菌(Streptosporangium)、螺旋游動(dòng)菌(Spirilliplanes)、草孢菌屬(Herbidospora)?、馬杜拉放線菌(Actinomadura)、指孢囊菌(Dactylosporangium)、小四孢菌(Microtetraspora)、地嗜皮菌(Geodermatophilus)、游魚孢菌(Sporichthya)等大量稀有放線菌。迄今為止，沒有那一種培養(yǎng)基能同時(shí)分離所有的微生物。由于放線菌是一類具有巨大應(yīng)用價(jià)值的微生物，所以開發(fā)放線菌資源就顯得尤為重要。一直以來，分離方法一直是限制人們開發(fā)利用這類微生物資源的“瓶頸”，尤其是高鹽環(huán)境下放線菌的純培養(yǎng)技術(shù)一直沒有突破，特別是針對(duì)高鹽環(huán)境下放線菌，沒有報(bào)道一種適合多種放線菌的培養(yǎng)基。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中未見報(bào)道一種適合多種放線菌的培養(yǎng)基的技術(shù)現(xiàn)狀，本專利技術(shù)目的在于提供一種分離高鹽環(huán)境放線菌的培養(yǎng)基及其應(yīng)用，填補(bǔ)了國(guó)內(nèi)外針對(duì)高鹽、寡營(yíng)養(yǎng)的特殊環(huán)境和高鹽環(huán)境沒有一種培養(yǎng)基適合多種高鹽環(huán)境放線菌的培養(yǎng)分離問題，為放線菌資源的開發(fā)提供菌種支撐具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值。本專利技術(shù)采用的主要技術(shù)方案：本專利技術(shù)結(jié)合嗜鹽放線菌對(duì)不同鹽離子類型的選擇和適應(yīng)性生理學(xué)特點(diǎn)，設(shè)計(jì)分離培養(yǎng)基，全面挖掘鹽湖沉積物放線菌資源，客觀認(rèn)識(shí)鹽湖沉積環(huán)境中放線菌的物種多樣性，結(jié)合沉積物樣品離子類型如陽離子Na+、K+、Mg2+、Ca2+等、陰離子Cl-、CO32-、SO42-、HCO3的多樣性，設(shè)計(jì)分離培養(yǎng)基，從而獲得更多的放線菌資源。本專利技術(shù)提供的一種分離高鹽環(huán)境放線菌的培養(yǎng)基，按照重量百分比計(jì)，培養(yǎng)基由甘露醇1%、丙氨酸0.1%、K2HPO4?0.1%、MgSO4·7H2O?0.1%、CaCO3?0.02%、FeSO4·7H2O?0.001%、Agar?1.8%、微量鹽0.0003?%、復(fù)合維生素0.0004%、生物素0.000025%、重鉻酸鉀0.005%組成；其中，微量鹽由FeSO4·7H2O、?MnCl2·4H2O?和?ZnSO4·7H2O各?0.0001?%組成；復(fù)合維生素由B1、?B2、?B6、煙酸、肌醇、泛酸、對(duì)氨基苯甲酸、葉酸各0.00005%組成；?pH?7.2-7.4。該分離高鹽環(huán)境放線菌的培養(yǎng)基以下簡(jiǎn)稱Z5分離培養(yǎng)基。本專利技術(shù)中提供的重鉻酸鉀為培養(yǎng)基的非目的菌抑制劑。通過實(shí)施本專利技術(shù)具體的
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
，可以達(dá)到以下效果：本專利技術(shù)提供的分離高鹽環(huán)境放線菌的培養(yǎng)基與現(xiàn)有技術(shù)相比，現(xiàn)有技術(shù)中報(bào)道的經(jīng)典培養(yǎng)基，分離放線菌種類都比較單一，最多也只能分離到3個(gè)屬5個(gè)不同種的放線菌；而本專利技術(shù)提供的培養(yǎng)基分離放線菌結(jié)果為11個(gè)屬22個(gè)種，適合高鹽、寡營(yíng)養(yǎng)的特殊環(huán)境和高鹽環(huán)境放線菌的分離。本專利技術(shù)站在營(yíng)養(yǎng)生理學(xué)的角度，考慮到鹽湖是一個(gè)高鹽、寡營(yíng)養(yǎng)的特殊環(huán)境和高鹽環(huán)境放線菌生長(zhǎng)緩慢等因素，以微生物對(duì)滲透壓的反應(yīng)為指導(dǎo)，設(shè)計(jì)了以不同碳源和氮源為基礎(chǔ)的培養(yǎng)基，適合高鹽、寡營(yíng)養(yǎng)的特殊環(huán)境中分離多種放線菌，是目前報(bào)道能夠分離高鹽環(huán)境放線菌最多的一種培養(yǎng)基。具體實(shí)施方式下面，舉實(shí)施例說明本專利技術(shù)，但是，本專利技術(shù)并不限于下述的實(shí)施例。另外，在下述的說明中，如無特別說明，％皆指質(zhì)量百分比。主要儀器：PCR儀為德國(guó)SensoQuest?Labcycler；高速冷凍離心機(jī)為BeckMan公司Allegra?64R?Centrifuge；凝膠成像分析系統(tǒng)為Bio-Rad公司Gel?Doc?2000；電泳儀為北京六一DYY-6C。試劑：用于PCR擴(kuò)增的全套試劑均購自廣州東盛生物科技有限公司；限制性內(nèi)切酶HaeIII及連接試劑盒PMD18-T購自TaKaRa公司；其他生化試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。本實(shí)驗(yàn)所有培養(yǎng)基中均添加1.5%、5%、10%、15%、20%、25%?6個(gè)濃度梯度的NaCl，分離高鹽環(huán)境放線菌的培養(yǎng)基以下簡(jiǎn)稱Z5分離培養(yǎng)基。本專利技術(shù)中選用的所有試劑和儀器都為本領(lǐng)域熟知選用的，但不限制本專利技術(shù)的實(shí)施，其他本領(lǐng)域熟知的一些試劑和設(shè)備都可適用于本專利技術(shù)以下實(shí)施方式的實(shí)施。實(shí)施例一：分離高鹽環(huán)境放線菌的培養(yǎng)基的制備按照重量百分比計(jì)，培養(yǎng)基由甘露醇1%、丙氨酸0.1%、K2HPO4?0.1%、MgSO4·7H2O?0.1%、CaCO3?0.02%、FeSO4·7H2O?0.001%、Agar?1.8%、微量鹽0.0003?%、復(fù)合維生素0.0004%?、生物素0.000025%、重鉻酸鉀0.005%組成；其中，微量鹽由FeSO4·7H2O、?MnCl2·4H2O?和?ZnSO4·7H2O各?0.0001?%組成；復(fù)合維生素由B1、?B2、?B6、煙酸、肌醇、泛酸、對(duì)氨基苯甲酸、葉酸各0.00005%組成；?pH?7.2-7.4。實(shí)施例二：分離高鹽環(huán)境放線菌的培養(yǎng)基的供試土樣??鹽湖樣品采自位于新疆阿圖什市境內(nèi)的硝爾庫勒湖。該湖呈東北-西南向分布,?湖長(zhǎng)18-20?km,?寬2-4?km,?面積?45?km2,?海拔為1585?m?(?76°53'?E，40°10'?N?)。樣品采集后立即裝入無菌的封口袋并置于車載冰箱。運(yùn)抵實(shí)驗(yàn)室后于-20℃保存?zhèn)溆谩?shí)驗(yàn)選取其中一份沉積物樣品進(jìn)行分離模型的研究。1.樣品本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種分離高鹽環(huán)境放線菌的培養(yǎng)基，其特征在于，按照重量百分比計(jì)，所述的培養(yǎng)基由甘露醇1%、丙氨酸0.1%、K2HPO4？0.1%、MgSO4？7H2O？0.1%、CaCO3？0.02%、FeSO4？7H2O？0.001%、Agar？1.8%、微量鹽0.0003？%、復(fù)合維生素0.0004%、生物素0.000025%、重鉻酸鉀0.005%組成；其中，微量鹽由FeSO4？7H2O、？MnCl2？4H2O？和？ZnSO4？7H2O各？0.0001？%組成；復(fù)合維生素由B1、？B2、？B6、煙酸、肌醇、泛酸、對(duì)氨基苯甲酸、葉酸各0.00005%組成；？pH？7.2？7.4。

【技術(shù)特征摘要】
1.一種分離高鹽環(huán)境放線菌的培養(yǎng)基，其特征在于，按照重量百分比計(jì)，所述的培養(yǎng)基由甘露醇1%、丙氨酸0.1%、K2HPO4?0.1%、MgSO4·7H2O?0.1%、CaCO3?0.02%、FeSO4·7H2O?0.001%、Agar?1.8%、微量鹽0.0003?%、復(fù)合維生素0.0004%、生物素0.000025%、重鉻酸鉀...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：張利莉，陳正軍，李艷賓，關(guān)統(tǒng)偉，夏占峰，張瑤，張嬌，呂玲玲，賈曉宇，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：塔里木大學(xué)，
類型：發(fā)明
國(guó)別省市：