小鼠胎肝細胞PL08及其建立方法和在紅細胞前體細胞培養與增殖中的應用技術

本發明專利技術公開了一種新的小鼠胎肝細胞系PL08（CCTCC?NO:C201297）在紅細胞前體細胞體外培養與增殖中的應用。該細胞系作為基質細胞，能很好地支持臍帶血紅細胞前體細胞的體外培養與增殖，為臨床臍帶血紅細胞前體細胞提供更豐富的細胞資源。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及利用一種新細胞系，特別是小鼠胎肝細胞PL08[保藏日期：2012年8月3日、保藏單位：中國典型培養物保藏中心（CCTCC）、保藏編號：C201297]及其建立方法和應用。?
技術介紹
紅細胞前體細胞（erythroid?progenitors）由造血干細胞分化而來，可以繼續分化為成熟的紅細胞。紅細胞前體細胞在應急性輸血和治療貧血癥等臨床應用上有廣泛需求。人類的紅細胞前體細胞（或稱為有核紅細胞），其主要表面標記分子為GPA和CD71。?目前，臍帶血紅細胞前體細胞的體外培養仍然十分困難。找到有效的方法在體外擴增和培養臍帶血紅細胞前體細胞是當前該領域研究的一個熱點。?
技術實現思路
本專利技術的目的為：提供一種新的小鼠胎肝細胞系PL08及其建立方法，以及該細胞系在體外培養和增殖臍帶血紅細胞前體細胞。?技術方案為：使用PL08細胞系作為基質細胞，與臍帶血紅細胞?前體細胞共培養。?PL08細胞系是專利技術人建立的一株小鼠胎肝細胞系。其建立的過程如下：?取C57/BL6小鼠第11天的胎肝，用帶有27G針頭的無菌注射器反復吹打，以使組織解離，分散為單個細胞。用紅細胞裂解液去除紅細胞后，將細胞培養在0.1％明膠包被過的細胞培養板上，培養基成分為：aMEM培養基，添加15％的胎牛血清。經過4到5天的培養，去除上清，將貼壁細胞用0.05％的胰酶消化下來，常規方法擴大培養、傳代，每次傳代過程中保留30％的原培養液，添加70％的新鮮培養液。在本實驗室，PL08細胞系已經穩定傳代60代以上，培養時間超過1年，細胞大小均一，生長速度穩定。?PL08細胞系為亞三倍體核型，染色體條數為58-62條（見圖1）。該細胞系在添加10％胎牛血清的aMEM培養基中生長良好，接種后1至2天的細胞群體倍增時間為22.4小時，最適生長溫度為37攝氏度，最適生長PH值為7.2。?經實驗證實，PL08細胞系可以很好的支持臍帶血紅細胞前體細胞的生長，在體外培養紅細胞前體細胞的研究中有巨大的應用價值。?附圖說明圖1為該細胞系124代核型分析圖像。?圖2是培養細胞顯微圖像。?圖3是臍帶血紅細胞前體細胞在普通培養條件下和與PL08共培?養條件下，在不同的培養時間段做流式細胞分析的結果。?圖4是臍帶血紅細胞前體細胞在普通培養條件下和與PL08共培養條件下培養12天，細胞形態比較結果。?小鼠胎肝細胞PL08保藏日期：2012年8月3日；保藏單位：中國典型培養物保藏中心（CCTCC）；保藏編號：C201297。?具體實施方式下述實施例中，所用試劑材料及其來源包括：?PL08細胞系由李鵬博士構建。臍帶血由廣州臍帶血干細胞庫提供。流式抗體GPA/CD71為eBioscience產品。StemSpan無血清培養基為STEMCELL公司產品。細胞因子human?Insulin-like?growth?factor(hIGF)、Human?Erythropoietin(hEPO)、human?stem?cell?factor(hSCF)、human?interleukin?3(hIL3)為PeproTech公司產品。Lipids和Dexametasone為Sigma-Aldrich公司產品。細胞培養板為Corning?Costar公司產品。Lymphoprep淋巴細胞分離液為Axis-shield公司產品。?實施例1PL08作為基質細胞在紅細胞前體細胞體外培養中的應用?臍帶血解凍后，重懸于20ml?PBS緩沖液中。使用Lymphoprep淋巴細胞分離液分離白細胞，隨后對分離到的細胞進行計數。得到的細胞分兩組培養：第一組作為對照組，培養在stemspan培養基中，添?加的細胞因子及濃度如下：lipids(40ug/ml)，Dexametasone(1um)，hEPO(20ng/ml)，hSCF(100ng/ml)，hlGF1(40ng/ml)，hlL3(10ng/ml)。第二組作為實驗組，與PL08基質細胞共培養，培養基及細胞因子成分與第一組相同。?如圖3流式細胞數據所示，實驗組在培養12天，18天時仍有大量的紅細胞前體細胞，而對照組的在第12天就已經全部分化，具體表現為不能通過流式細胞技術檢測到GPA+/CD71+細胞。如圖4，對照組細胞（圖4A）大量死亡，試驗組細胞(圖4B)生長良好，顯示PL08細胞系對紅細胞前體細胞生長的良好支持作用。?本文檔來自技高網...

【技術保護點】
小鼠胎肝細胞PL08CCTCC？No.C201297。

【技術特征摘要】
1.小鼠胎肝細胞PL08CCTCC?No.C201297。
2.小鼠胎肝細胞PL08的建立方法：
a.取C57/BL6小鼠第11天的胎肝，用帶有27G針頭的無菌注射器
反復吹打，以使組織解離，分散為單個細胞；
b.用紅細胞裂解液去除紅細胞后，將細胞培養在0.1％明膠包被過
的細胞培養板上，培養基成分為：aMEM培養基，添加10％-15％
的胎牛血清；
c.經過4到5天的培養，去除上清...

【專利技術屬性】
技術研發人員：李鵬，劉志新，
申請(專利權)人：中國科學院廣州生物醫藥與健康研究院，
類型：發明
國別省市：