農作物轉基因成份檢測法及所用芯片制造技術

本發明專利技術公開了一種農作物轉基因成份檢測法，包括以下步驟：一、制備轉基因成份檢測芯片；針對轉基因農作物的內源、外源、品系這三類基因，選擇特異性探針，每條特異性探針的5'進行氨基修飾；然后將氨基修飾后的探針固定醛基玻片上，預雜交后，得轉基因成份檢測芯片；?二、檢測：1）、利用已知標準，獲取轉基因片段的引物；2）、農作物待測樣品中DNA的提取，得提取液；3）、靶基因的多重PCR擴增；4）、芯片雜交檢測：將擴增產物與轉基因成份檢測芯片雜交；然后進行熒光探針雜交，再利用T4DNA連接酶進行酶連接，接著用NaOH變性，最后用洗液洗滌；?5）、雜交結果的檢測與分析：掃描所得的芯片，對結果進行分析。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術屬于分子生物學檢測技術，尤其是涉及大豆、玉米等相關產品的轉基因成份檢測。?
技術介紹
轉基因，是指運用科學手段從某種生物中提取所需的基因，將其轉入另一種生物中，使之與另一種生物的基因進行重組，從而產生特定的具有優良遺傳性狀的物質。利用轉基因技術，可以改變動植物性狀、培育新品種；也可以利用其他生物體培育出人類所需要的生物制品，用于醫藥、食品等方面。轉基因是基因工程的重要組成部分。?全球轉基因作物發展勢頭強勁。據專家提供的權威資料，2010??年全球轉基因作物種植面積達到?1.48?億公頃，是?1996?年的?87?倍，15?年間年均增長近?5?倍。1996?年全球種植轉基因作物的國家僅?6?個，2010?年已達?29?個。4?大主要轉基因作物種植面積也創新高。全球大豆面積的五分之四（81%）、棉花面積的三分之二（64%）、玉米面積的三分之一（29%）、油菜面積的四分之一（23%）種植的都是轉基因品種。??全球有近?40?個國家和地區雖未正式批準轉基因作物商業化種植，但允許進行試驗研究或進口轉基因作物原料用于飼料和食品加工。2010?年有?8?個歐盟成員國批準種植抗蟲玉米等轉基因作物；歐盟生物安全委員會宣布各國可自主決定是否種植轉基因作物；瑞典首次批準種植轉基因優質淀粉馬鈴薯。2008??年全球轉基因作物產品總收益超過?1300?億美元。?截至目前，中國共批準發放?7?種轉基因植物的農業轉基因生物安全證書，即1997?年發放的耐貯存番茄、抗蟲棉花安全證書，1999?年發放的改變花色矮牽牛和抗病辣椒（甜椒、線辣椒）安全證書，2006??年發放的轉基因抗病番木瓜安全證書，2009??年發放的轉基因抗蟲水稻和轉基因植酸酶玉米安全證書。根據中國農業生物技術學會數據顯示，2010?年中國種植轉基因作物種植面積達到?350?萬公頃，排名世界第六。其中轉基因棉花約?330?萬公頃，其余是轉基因木瓜、轉基因番茄、轉基因辣椒等，所有作物都獲得農業部頒發的轉基因生物安全證書的農作物品種，是政策允許范圍內種植的。?然而在安全性方面，有一些學者認為目前人類對基因的活動方式了解的還不夠透徹，對控制基因調整后的結果沒有十足的把握。當一種功能基因移入另一機體中，這種基因的功能可能發生不可預測的變化，而機體的相應反應更不可預測。?對于轉基因作物的擔心主要有兩方面：（1）轉基因生物對生物多樣性的影響；（2）轉基因生物對人體健康的威脅。?由于基因工程是一個新的領域，人們還難以完全準確地預測到轉基因植物潛在危險性。雖然迄今已商品化的轉基因食品尚無對人體有毒副作用的報道，但并非轉基因植物完全沒有不可預見的負效應。2001?年?5月，我國《農業轉基因生物安全條例》開始實施,?要求對大豆、玉米、油菜類轉基因食品必須加以標識。我國農業部?2003?年初在全國范圍內進行轉基因產品安全管理的執法大檢查。按照國家農業部第?10?號令《農業轉基因生物標識管理辦法》規定，自?2003?年?3?月?20?日起，國家對農業轉基因生物實行標識制度，要求對五大類?17?種農業轉基因生物進行標識。但真的要使這些法規、制度得以實施，關鍵還在于有一個有效的檢測技術。為此，科研人員分別從檢測外源蛋白和檢測外源?DNA?著手，建立了一系列檢測方法。?
技術實現思路
本專利技術要解決的技術問題是提供一種靈敏度高、操作簡便、假陽性率低的農作物轉基因成份檢測法。?為了解決上述技術問題，本專利技術提供一種農作物轉基因成份檢測法，包括以下步驟：?一、制備轉基因成份檢測芯片；?針對轉基因農作物的內源、外源、品系這三類基因，選擇特異性探針，每條特異性探針5'進行氨基修飾；然后將氨基修飾后的探針固定醛基玻片上，預雜交后，得轉基因成份檢測芯片；?二、檢測：?依次進行以下步驟：?1）、利用已知標準，獲取轉基因片段的引物；?2）、農作物待測樣品中DNA的提取，得提取液；?3）、靶基因的多重PCR擴增：?以步驟2）的提取液作為PCR模板，利用步驟1）所得的引物進行多重PCR擴增；得擴增產物；?4）、芯片雜交檢測：?將擴增產物與轉基因成份檢測芯片雜交；然后進行熒光探針雜交，再利用T4DNA連接酶進行酶連接（即，利用T4DNA連接酶補齊），接著用NaOH變性，最后用洗液洗滌；??熒光探針為與特異性探針相對應的熒光探針；?5）、雜交結果的檢測與分析：?用掃描儀掃描上述步驟4）所得的芯片，利用常規軟件對結果進行分析。?作為本專利技術的農作物轉基因成份檢測法的改進：?步驟4）中：?進行熒光探針雜交的具體內容如下：?將濃度為2~3?μM的每種熒光探針等體積混合后，得熒光探針混合液；將熒光探針混合液與雜交液按1：1體積比混合后，與前述步驟所得的已經與擴增產物雜交的轉基因成份檢測芯片進行雜交；47~49℃孵育?29~31?分鐘，室溫靜置8~12分鐘；?雜交液由20×SSC?100ml、10%?SDS?4ml、10%?BSA?40ml和dd?H?2O?276ml組成。?酶連接反應體系為：?0.05U/μl?T4?連接酶反應液?1μl，?T4?10×Buffer?2?μl；水（18.2兆歐姆的水）補足到?20μl；?NaOH變性為：利用濃度為0.3M的NaOH溶液洗滌4~6分鐘。?作為本專利技術的農作物轉基因成份檢測法的進一步改進：?步驟4）中的洗液為洗液(2×SSC，0.5％SDS)。?作為本專利技術的農作物轉基因成份檢測法的進一步改進：?熒光探針如下表所示：?。?在本專利技術中，步驟一（制備轉基因成份檢測芯片）的具體內容如下：?1）轉基因片段的探針設計?對大豆、玉米、油菜等國家規定需檢出的內源、外源、品系設計特異性擴增探針（即，特異性探針），每條特異性探針均必須符合以下條件：5'端需要氨基修飾，探針長度為20～30mer，探針之間Tm值差異在5度之內，各探針內部發夾結構≤5個、GC含量為40%～55%、重復的單一堿基的連續≤5個，分子最穩定的二級結構配對堿基長度少于6bp；于上海invitrogen公司合成。?上述特異性探針如表1所示。?農作物為大豆、玉米、油菜、大米等等。?2）、芯片制備：?將步驟1）所得到的特異性探針，用18.2兆歐姆的水稀釋成30pmole/μl，然后與點樣緩沖液等體積混勻，利用點樣儀固定在醛基玻片上。然后放在100%相對濕度的密閉容器中，37℃水化?8?小時；70?℃干燥?2?小時，洗液(2×SSC，0.5％SDS)洗兩次，每次?5?分鐘，水洗兩次，每次?5?分鐘，吹干片子，4℃保存，得到固定好探針的醛基玻片，備用。?固定好樣本的醛基玻片預雜交：在玻片上加入預雜交液；37℃度孵育一小時，洗液(2×SSC，0.5％SDS)洗兩次，每次?5?分鐘，水洗兩次，每次?5?分鐘，吹干，待用。?預雜交液由20×SSC?100ml、10%?SDS?4ml、10%?本文檔來自技高網...

【技術保護點】
農作物轉基因成份檢測法，其特征是包括以下步驟：一、制備轉基因成份檢測芯片；針對轉基因農作物的內源、外源、品系這三類基因，選擇特異性探針，每條特異性探針的5“進行氨基修飾；然后將氨基修飾后的探針固定醛基玻片上，預雜交后，得轉基因成份檢測芯片；二、檢測：依次進行以下步驟：？？？1）、利用已知標準，獲取轉基因片段的引物；？？？2）、農作物待測樣品中DNA的提取，得提取液；3）、靶基因的多重PCR擴增：以步驟2）的提取液作為PCR模板，利用步驟1）所得的引物進行多重PCR擴增；得擴增產物；4）、芯片雜交檢測：將擴增產物與轉基因成份檢測芯片雜交；然后進行熒光探針雜交，再利用T4DNA連接酶進行酶連接，接著用NaOH變性，最后用洗液洗滌；？所述熒光探針為與特異性探針相對應的熒光探針；5）、雜交結果的檢測與分析：用掃描儀掃描上述步驟4）所得的芯片，利用常規軟件對結果進行分析。

【技術特征摘要】
1.農作物轉基因成份檢測法，其特征是包括以下步驟：
一、制備轉基因成份檢測芯片；
針對轉基因農作物的內源、外源、品系這三類基因，選擇特異性探針，每條特異性探針的5'進行氨基修飾；然后將氨基修飾后的探針固定醛基玻片上，預雜交后，得轉基因成份檢測芯片；
二、檢測：
依次進行以下步驟：
???1）、利用已知標準，獲取轉基因片段的引物；
???2）、農作物待測樣品中DNA的提取，得提取液；
3）、靶基因的多重PCR擴增：
以步驟2）的提取液作為PCR模板，利用步驟1）所得的引物進行多重PCR擴增；得擴增產物；
4）、芯片雜交檢測：
將擴增產物與轉基因成份檢測芯片雜交；然后進行熒光探針雜交，再利用T4DNA連接酶進行酶連接，接著用NaOH變性，最后用洗液洗滌；?
所述熒光探針為與特異性探針相對應的熒光探針；
5）、雜交結果的檢測與分析：
用掃描儀掃描上述步驟4）所得的芯片，利...

【專利技術屬性】
技術研發人員：張明哲，張曉峰，陳笑梅，吳姍，陳曦，
申請(專利權)人：浙江省檢驗檢疫科學技術研究院，
類型：發明
國別省市：