老年性癡呆病變前期ALPHA-2基因mRNA水平原位雜交篩查試劑盒及篩查方法和應用技術

本發明專利技術公開一種原位雜交檢測試劑盒，包括雜交探針和標記物。還公開使用本試劑盒原位雜交檢測與老年性癡呆（Alzheimer’sDisease-AD）前期病理演變有密切相關的ALPHA-2基因mRNA的方法，包括以下步驟：（1）在雜交探針與靶序列可形成穩定雜交復合體的條件下，將底物中待測RNA與雜交探針接觸，形成雜交復合體；和（2）檢測所述雜交復合體。本發明專利技術的試劑盒和檢測方法可以在，mRNA水平上檢測ALPHA-2基因的表達功能，比現有的臨床生化檢測指標和影像醫學檢查更早期，能實現真正的老年性癡呆（AD）病變前期mRNA水平的篩查，做到預防性診治的目的。同時，本發明專利技術的檢測方法簡單方便，成本低,便于醫院推廣應用。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及生物檢測領域，更具體地說，是涉及與老年性癡呆（AD）病變前期mRNA表達改變(病理演變過程)的相關檢測技術。??
技術介紹
阿爾茨海默病(??Alzheimer’s?disease-,AD)是最常見的癡呆類型，占所有癡呆的60%~80%，也是致殘率高和負擔大的疾病之一。到2006年，人類第一殺手心臟病死亡率比2000年下降了11.5%，第二殺手卒中死亡率下降了18.1%，但阿爾茨海默病的死亡率卻上升了47.1%，成為老年人的第5位致死原因。隨著全球性人口規模和預期壽命的增加，阿爾茨海默病已成為世界衛生問題，根據未來的預測，癡呆患病率每二十年增加近一倍，至2030年將達到6570萬，到2050年將達到1億1540萬。各國阿爾茨海默病患者數增加不是均衡的。發達國家的癡呆人數預測以100%的比例增長，而中國/印度及其南亞和西太平洋鄰國等發展中國家將以超過300%的比例增長，中國的AD人數則將以336%的比例增長。中國是世界上人口老化基數最大國家，截止2008年底，我國60歲以上老年人口已接近1.69億，占總人口的12%。根據2005年北京協和醫院領導的一項跨省市（北京/上海/成都/西安）流行病學調查結果估計，65歲以上老年人AD患病率為4.8%，且隨著年齡增長而增加。因此，中國絕不是一個AD低發國家，恰恰相反，而是世界上AD人數最多且增長速度最快的國家。因此迅猛增加的疾病負擔必將對我國的社會經濟發展和家庭生活產生重要影響。????AD是世界上致殘率高且負擔重的疾病。按照2003年度世界衛生組織報導的關于全球疾病負擔的估計，60歲以上老年人中癡呆導致殘疾的占11.2%，遠高于卒中（9.5%）、骨骼肌障礙（8.9%）、心血管病（5%）及各種類型的癌癥（2.4%）。據美國一個跨學科專家組的共識估計，除脊髓損傷和晚期癌癥以外，AD致殘加權顯著高于任何其他健康狀況。在美國，AD人口已超過500萬，AD的花費已超過1000億美元，估計到2050年AD患者人數將以幾何級數方式增長到1300萬人,經過核算，每年將花費1400億美元。?AD已成為重大的公共衛生問題，并確定為未來幾年公共衛生問題的研究重點。AD是一種常見的神經系統退行性疾病,?臨床表現為進行性認知功能減退，典型病理改變為老年斑(?sen?ile?plaque,?SP)、神經原纖維纏結(?neurona?l?fibrillary?tang?les,?NFT)?及神經元丟失,?另外伴有顆粒空泡變性(?granulov?acuolar?degeneration,GD),平野小體和腦血管的改變。經過數十年有關AD的病因和發病機制的研究后，雖然對AD的病因還有許多不了解，但是對其病理和生理機制有了肯定和全面的認識，并從中發現了一些重要的疾病標志。現代分子遺傳學在幫助人類認識AD的發病機制方面意義非凡，發現常染色體突變能導致Aβ42肽的表達增多，參與的基因包括ALPHA-2?基因。AD的生物標志物能很好地幫助臨床診斷，與病理發現有良好的一致性。2010年美國國立老化研究院和阿爾茨海默病聯合會推薦新的診斷定義與標準，強調將記憶損害與生物標志物結合。AD是疾病的整個臨床過程，包括了AD癡呆前期和癡呆期AD。AD的臨床前驅期則指出現早期病理生理學改變至出現最早的認知癥狀之間漫長的階段。當前，臨床使用的AD治療藥物不少，但均缺乏有臨床意義的療效。癡呆是嚴重的認知功能損害，呈進展性和不可逆性，要通過藥物干預實現病情穩定或緩解是極其困難的。因此，對癡呆實施預防應該是一個重要的臨床研究方向。最新AD研究報告表明，作為“嬰兒”這一代，到2050年在美國將有1千3百50萬人成為AD癡呆患者。如果，假設有一種干預可以是AD癡呆的發病延遲5-10年或提早5-10預測和篩查，那么AD癡呆患者人數將減少80%，用于AD的預計醫療費用將會大大減少。中國現有AD患者以超過800多萬，而且，發病人數每年在上升。因此，尋找有效AD篩查工具，對臨床前期AD患者及未發生AD高危人群的早期篩查，在人群中盡早開展干預治療，減少AD的最終發生率有重要的臨床和時代意義。盡早開發出應用于AD病變前期mRNA水平篩查試劑盒，這將改變目前臨床上的AD發生后的診治模式，將AD的診治提高、提前到病變前期，做到預防性（治未病）的早期介入和治療，并進一步做到mRNA水平的調控及基因早期治療，將AD消滅在萌芽狀態。本專利技術人在長期研究中發現，導致老年性癡呆治療效果不佳的主要原因是不能做到真正的早期診斷和早期治療。本課題擬采用核酸原位雜交技術，尋找與AD發病密切相關的ALPHA-2基因一級轉錄功能產物-mRNA，觀察其在AD病人、高危人群、正常對照人群表達變化，統計分析其臨床應用意義和價值，并培養、開發出可應用于臨床的早期篩查試劑盒，用于臨床前期AD患者及高危人群的早期篩查，做到預防性診治，盡早開展干預治療，減少AD的最終發生率。隨著分子生物技術日益完善，功能基因組學，疾病基因組學等研究的深入展開，為了尋求更早期的篩查和治療老年性癡呆、以及預防老年性癡呆，已取得長足進步。至今，我們已有可能在基因的一級轉錄功能產物（mRNA水平）上做更精確的早期篩查和診斷，在老年性癡呆癥的基因生理病理學演變前期,就可以做到早期預測和篩查。本專利技術采用核酸原位雜交技術，選擇多組臨床標本（老年性癡呆患者、高危人群、正常對照），對ALPHA-2基因與老年性癡呆癥的早期預警進行檢測分析。ALPHA-2基因的mRNA作為早期篩查老年性癡呆病變前期有非常重要的臨床診斷意義。ALPHA-2基因的mRNA在老年性癡呆癥前期及病變過程中表達過度。它作于老年性癡呆病變前期篩查、及老年性癡呆癥早期預防的檢測指標及治療后的復發預警也有非常重要的臨床意義。專利技術人在長期的研究中，得出了一種新理念，臨床的重大疾病的臨床診治模式一定要改變，不能只停留現在治已病（發病后診治），要做到預防性診治，做到治已病，只有這樣才能降低重大疾病的發病率和死亡率，降低社會成本和醫療成本。因此，專利技術人在開發和生產重大疾病的mRNA水平篩查試劑盒及治療藥物中，在理論和技術上都做了大膽創新。特別是篩選臨床標本（正常人群、高危人群、疾病患者），突破了正常組織與疾病組織比較的一貫性研發思路，來尋找和開發病變期前mRNA水平，與疾病早期基因病理生理學演變密切相關，而且臨床意義非常重要靶標，將臨床上疾病形成后診治模式變成疾病的預防性診治，爭取了疾病診治的時間和空間，達到預防重大疾病。根據現有的文獻資料ALPHA-2基因mRNA水平的檢測技術及試劑盒未見報道。本專利技術人在對（老年性癡呆患者、高危人群、正常對照人）例組，用原位雜交技術進行檢測，結果表明以上老年性癡呆癥ALPHA-2基因都過度表達，高危人群有不同程度表達15-25%,正常人都是零表達。表明ALPHA-2基因是老年性癡呆病變前期篩查的重要標志物。原位雜交技術（in?situ?hybridization）是將分子生物學與細胞化學技術結合起來，以標記的核酸分子為探針，在組織細胞原位檢測特異性核酸分子的技術。其原理是使含有特異序列、經過本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種原位雜交檢測試劑盒，包括雜交探針和標記物，其特征在于，所述的雜交探針為序列表SEQ？ID？NO.1所示序列。

【技術特征摘要】
1.一種原位雜交檢測試劑盒，包括雜交探針和標記物，其特征在于，所述的雜交探針為序列表SEQ?ID?NO.1所示序列。
2.如權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述的標記物選自放射性物質、化學發光或顯色物質、生物素、金屬鱟、熒光素、酶及納米材料。
3.如權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，該試劑盒還包括雜交液。
4.如權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，該試劑盒還包括增效劑。
5.如權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，該試劑盒還包括顯色劑。
6.一種ALPHA-2基因原位雜交檢測方法，其特征在于，該方法包括以下步驟：
（1）在權利要求1所述的雜交探針與靶序列可形成穩定雜交復合體的條件下，將底物中...

【專利技術屬性】
技術研發人員：張玉麗，裘建英，張云福，裘霖，
申請(專利權)人：芮屈生物技術上海有限公司，
類型：發明
國別省市：