應用蛋白質組學技術篩選植物抗旱相關候選基因的方法技術

本發明專利技術公開了應用蛋白質組學技術篩選植物抗旱相關候選基因的方法，其步驟包括：A.分別取干旱處理組和正常澆水處理組植物植株葉片，首先利用雙向凝膠電泳技術尋找差異蛋白，初步獲取與植物抗旱相關的候選基因；B.再通過質譜鑒定技術對所得差異蛋白進行復篩，進一步篩選獲取與植物抗旱相關的候選基因。本發明專利技術提供的篩選植物（尤其是白芥）抗旱相關候選基因的方法，能夠有效克服現有技術篩選效率不高的問題。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及植物生物
，具體涉及植物基因尤其是白芥抗旱相關候選基因的篩選方法。
技術介紹
植物的抗旱性是一個復雜的多基因控制系統，抗旱的轉錄因子可以調控一系列抗旱相關基因的表達，是一種十分有效的提高耐旱性的途徑。目前，已有研究從各種植物中發現和鑒定了幾十種與抗旱性相關的功能基因。白芥是十字花科植物重要的育種基因資源，受到歐美及國內一些學者的高度重 視。通過遠緣雜交，可以將白芥重要的抗性基因資源導入農作物等其他植物體內，因此白芥已成為創制作物新種質的重要的原始材料。白芥具有較強的抗旱性能(王艷萍等，2001 ;唐道城，2000),是重要的抗旱種質資源，篩選相關抗旱基因對開展抗旱基因工程研究具有重要意義針對白芥這一物種，Dong等(2012)報道了白芥在干旱和復水條件下葉片基因差異表達情況，發現由于干旱脅迫造成葉片中309個基因表達下調，248個基因表達上調。張寧寧(2012)采用PEG模擬干旱處理方法研究了白芥幼苗在干旱脅迫下的生理生化響應和應對干旱脅迫條件下的檸檬酸合酶表達情況。但兩者均沒有對具體的白芥相關抗旱基因及其篩選或克隆方法進行探討。基因篩選通常根據其植物體內的差異表達進行。比較不同細胞或不同基因型在基因表達上的差異，分離并克隆不同組織或同一組織不同發育階段差異表達的基因，不僅是研究生命過程分子機制的基礎，也是進行功能基因組學領域研究的前提。目前，篩選差異表達基因的方法主要有差別篩選技術、消減雜交技術、mRNA差異顯示技術、基因表達系列分析、抑制性消減雜交、基因芯片技術、Gene Calling技術等。但現有的篩選技術過分依賴于這些基因生物學功能和生物學表型，但是到目前為止，大多數生物學表型和基因生物學功能是未知的，因此，這些候選基因篩選方法的利用受到了很大的限制。植物體內真正發揮作用的是蛋白質，蛋白質扮演著構筑生命大廈的“磚塊”角色。蛋白質組學(Proteomics )研究涉及到對蛋白質組的組成成分即蛋白質組表達模式的研究，同時涉及到蛋白質組的功能即蛋白質組功能模式的研究。對蛋白質組成的分析鑒定是蛋白質組學與基因組學相對應的主要內容，它要求對蛋白質進行分離、鑒定的圖譜化。研究蛋白質組學的技術路線主要有兩條，一條是以雙向電泳加生物質譜的方法鑒定生物體系中各種蛋白的表達譜以及各蛋白表達程度的相對變化，另一條路線就是多維色譜與生物質譜相結合的稱之為鳥槍法的技術路線。其中國內外大多數研究是以雙向電泳為主要手段。雙向凝膠電泳(2-DE)技術是蛋白質高通量分離的首選技術，包括根據等電點原理對蛋白質進行等電聚焦的“一向”電泳和根據分子量不同進行SDS-PAGE的“二向”電泳。電泳后需要經過聚丙烯酰胺凝膠染色和蛋白點的圖象分析。經雙向電泳分離得到的目標蛋白質首先經胰蛋白酶酶解處理形成肽段，而后可以對得到的肽段用質譜技術來鑒定和分析
技術實現思路
本專利技術要解決的技術問題是提供一種篩選植物(尤其是白芥)抗旱相關候選基因的方法，用以克服現有技術篩選效率不高的問題。為解決上述技術問題，本專利技術所采取的技術方案如下。，其步驟包括A、分別取干旱處理組和正常澆水處理組植物植株葉片，首先利用雙向凝膠電泳技術尋找差異蛋白，初步獲取與植物抗旱相關的候選基因；B、再通過質譜鑒定技術對所得差異蛋白進行復篩，進一步篩選獲取與植物抗旱相關的候選基因。作為本專利技術的一種優選技術方案，步驟A的具體操作步驟包括 A-1、植物材料與葉片蛋白提取分別取干旱處理組和正常澆水處理組植物植株葉片，液氮研磨、離心、裂解處理，獲取葉片中的蛋白質樣品；A-2、雙向凝膠電泳處理對上步所得蛋白質樣品分別進行雙向凝膠電泳處理，等電聚焦采用PH4-7的預制IPG膠條進行，待第二向電泳結束后取下凝膠，放入固定液中室溫固定4h以上，然后放入考馬斯亮藍染色液中進行飽和染色，利用清水清洗凝膠之后即進行凝膠圖像掃描，得到干旱處理葉片與正常澆水葉片的蛋白雙向凝膠電泳圖；A-3、結果分析對上步所得雙向凝膠電泳圖進行統計分析，利用單因素方差分析，對對照組與處理組蛋白質表達量的比值進行以2為底的對數轉換，選擇在I log2expression ratio I會I、Ρ〈0· 05條件下對對照組與處理組蛋白質表達譜進行統計學分析，即獲得差異蛋白質；并進一步確定在干旱處理葉片中高表達的蛋白質，即初步篩選出與植物抗旱相關的候選基因。作為本專利技術的一種優選技術方案，步驟A-I的具體操作步驟為a、取植物種子在培養室內進行催芽后，PEG6000處理濃度為20%，以清水處理為對照，選取經濃度為20%的PEG6000處理第9天的植物幼苗葉片為實驗組和不做任何處理的植物幼苗葉片的為對照組進行O蛋白質差異性表達試驗；b、植物幼苗經PEG6000模擬干旱處理結束后同時取實驗組和對照組植株葉片，雙蒸水沖洗干凈后，用濾紙吸掉多余水分，迅速置于液氮中冷卻分裝標記后，置于-80°C冰箱中保存備用；C、在液氮中充分研磨葉片，加入樣品體積3倍的提取液在_20°C的條件下過夜，然后4°C 8000rpm以上離心I小時，棄上清，加入等體積的含O. 07% β -巰基乙醇的冰浴丙酮，搖勻后4°C SOOOrpm以上離心I小時，然后真空干燥沉淀，備用；d、上樣前加入裂解液，室溫放置30分鐘，使蛋白充分溶于裂解液中，然后15 0C 8000rpm以上離心I小時或更長時間，以沒有沉淀為標準，臨時保存在4°C，用Brandford法定量蛋白，然后分裝放入-80°C備用；作為本專利技術的一種優選技術方案，步驟c中的提取液為含10%TCA和O. 07%的β-巰基乙醇的丙酮；步驟d中裂解液的配制比例為2. 7g尿素O. 2gCHAPS溶于3ml滅菌的去離子水中，終體積為5ml，使用前再加入IM的DTT65ul/ml。作為本專利技術的一種優選技術方案，步驟A得到的蛋白樣品分別進行了雙向電泳和考馬斯亮藍染色處理，并通過分析獲得差異蛋白質點，在此基礎上，步驟B的具體操作步驟為首先從凝膠上切下差異蛋白質點，然后進行質譜分析和蛋白鑒定。作為本專利技術的一種優選技術方案，所述質譜分析的具體操作步驟包括I)將要進行質譜分析的凝膠用超純水清洗5min/次X 5次；2)根據所要分析的蛋白質點濃度及大小切去1000 μ I Eppondorf槍頭尖端,使用切好的槍頭從上述凝膠中切取所要分析的蛋白質點放入1.5ml EP管中；3)每管中加入100 μ I超純水,室溫下利用搖床震蕩洗漆15min,吸去超純水；重復此步驟兩次；4)每管中加入100 μ I膠內酶切脫色液，室溫下利用搖床震蕩脫色30min，吸去膠內酶切脫色液；重復此步驟4次至膠粒呈無色透明狀； 5)每管中加入100 μ I乙腈，室溫下搖床震蕩脫水lOmin，吸去乙腈；6)抽真空干燥25min至膠粒呈白色顆粒狀；7)每管中加入10 μ I酶液，置于4°C保持lh，吸去多余酶液；8)將EP管倒置，37°C保持12_14h，使蛋白質進行完全酶切；9)每管中加入30μ I肽段抽提液I，37°C保持lh，取上清液至新管內；10)向含膠粒的EP管中加入30 μ I肽段抽提液II，30°C保持lh，取上清液至步驟9中的含有上清液的管內；11)將所得到的含有肽段的抽提液進行真空干燥Ih左右，至余液為10μ I ；12本文檔來自技高網...

【技術保護點】
應用蛋白質組學技術篩選植物抗旱相關候選基因的方法，其特征在于：A、分別取干旱處理組和正常澆水處理組植物植株葉片，首先利用雙向凝膠電泳技術尋找差異蛋白，初步獲取與植物抗旱相關的候選基因；B、再通過質譜鑒定技術對所得差異蛋白進行復篩，進一步篩選獲取與植物抗旱相關的候選基因。

【技術特征摘要】

【專利技術屬性】
技術研發人員：黃進勇，黃依冰，馬盼盼，
申請(專利權)人：鄭州大學，
類型：發明
國別省市：