本發明專利技術涉及“雞-γ-干擾素基因序列，其重組工程菌及應用”，屬于生物技術領域。本發明專利技術對采用人工合成的序列如SEQ?ID?NO1或SEQ?ID?NO2，以釀酒酵母作為宿主菌株，得到了重組工程菌，經PCR、酶切、測序、SDS-PAGE、ELISA和CPE檢測結果表明：ChIFN-α和ChIFN-γ基因均能在宿主菌株中胞內表達，并表達蛋白具有明顯的生物學活性。實驗表明，本發明專利技術將釀酒酵母作為生物反應器生產雞干擾素藥用蛋白，不僅可以極大降低干擾素生產成本，而且可以在提供優質蛋白的同時達到改善機體免疫功能的目的，為利用酵母添加劑防治動物疫病奠定基礎。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及生物程領域，特別是涉及人工合成的雞干擾素基因序列，一種以釀酒酵母作為受體菌而得到的重組工程菌，其能進行胞內表達生產動物干擾素。
技術介紹
釀酒酵母(S a cch a romyces cerevisiae)是一種良好的營養與保健飼料添加劑， 其營養豐富，富含B族維生素、礦物質、消化酶、促生長因子和較齊全的氨基酸。使用酵母添加劑可以提高飼料蛋白含量，刺激有益菌生長，提高機體免疫力，促進營養物質消化吸收和動物生長發育。同時，釀酒酵母也是最早用于基因工程的酵母菌株，是真核生物生物學研究的模式生物，其表達蛋白能有效保持生物學活性，利用釀酒酵母表達系統，人類已經獲得一些重要藥用蛋白。雞α干擾素(ChIFN-α)和雞、干擾素(ChIFN-Y )具有高效廣譜的抗病毒、免疫調節、抗腫瘤細胞增殖、提高抗逆性和促進生長等多種重要生理功用，是養禽業用來防治雞新城疫、傳染性支氣管炎、傳染性喉氣管炎、傳染性法氏囊、減蛋綜合征等多種雞病毒性傳染病的重要藥物。盡管干擾素的臨床價值極高，但是目前因生產的高昂成本卻制約著其在畜牧業中的廣泛應用。
技術實現思路
針對上述領域中的缺陷，本專利技術提供一種人工合成的雞干擾素基因序列，并提供以釀酒酵母作為受體菌而得到的重組工程菌，利用釀酒酵母作為受體菌胞內表達雞干擾素，酵母發酵產量大，產物不需分離純化，直接飼喂含有雞干擾素的酵母飼料重組菌株，可以實現畜牧業中干擾素的低成本供給問題，在提供雞體營養物質的同時達到提高其免疫力的目的，避免了疫苗注射等繁瑣管理和飼喂抗生素等藥物帶來的畜產品藥物殘留問題。一種人工合成的雞干擾素基因YEChlFNR，其核苷酸序列如SEQ ID NOl所示。一種人工合成的雞干擾素基因YEChlFNG，其核苷酸序列如SEQ ID N02所示。一種重組表達載體，具有上述人工合成的雞干擾素基因YEChlFNR，或YEChlFNG， 其骨架載體為PYES2/CT。一種重組工程菌，具有上述人工合成的雞干擾素基因YEChlFNR，或YEChlFNG，所述受體菌為釀酒酵母菌株INVScl。上述重組工程菌生產藥用蛋白雞干擾素的方法，包括如下步驟(I)、酵母菌的培養保種的重組工程菌接種于SC選擇培養基上，于30°C，200r/ min過夜震蕩培養；(2)、酵母菌的誘導表達培養當過夜培養的新鮮菌液0D600=0. 3-0. 5時，離心收集菌體并用含半乳糖的液體誘導培養基重懸，并于30°C、200r/min振蕩培養。所述誘導培養的條件為誘導12h，重組菌液發酵pH值為3. 8-4. 0,2. 5%的半乳糖濃度。所述步驟還包括保種的重組工程菌的制備方法，將重組工程菌在YPD篩選培養基培養，菌落PCR篩選，挑取陽性克隆單菌落，SC選擇培養基，30°C振蕩過夜培養保種。所述步驟還包括菌體細胞的裂解，所述步驟(2)的酵母菌培養到對數生長期時，取出轉速1500rpm/min離心5min收集菌體,滅菌水重懸菌體細胞之后，10000r/min離心30s, 得菌體細胞用裂解緩沖液重懸。所述菌體細胞裂解前液氮冷凍后置_80°C保存備用，裂解緩沖液重懸的 0D_=50_100。所述SC選擇培養基為0. 8%Ura缺陷培養基粉+2%葡萄糖；所述YPD篩選培養基為2%胰蛋白胨+1%酵母提取物，2%葡萄糖+60mg/l Amp (氨節青霉素)；所述誘導培養基為O. 8%Ura (尿嘧啶)缺陷培養基粉+2%半乳糖+1%棉子糖或者2%葡萄糖。本研究通過構建雞干擾素基因ChIFN的釀酒酵母表達載體，并通過電擊法將其轉化酵母菌株INVScl，對重組菌株的pH值、誘導時間和誘導劑濃度等誘導條件進行優化，并對重組蛋白及其生物學活性進行進檢測和分析，證明功能基因已在受體菌中獲得正確翻譯表達，重組ChIFN-α和ChIFN-Y蛋白具有抗病毒活性，為開發具有抗病功能的飼料微生物添加劑奠定了基礎。本研究對探索禽流感等病毒性疾病的防治新途徑和保證家禽的安全生廣具有積極的意義。本專利技術通過釀酒酵母生物反應器表達生產動物藥用蛋白，極大地降低生產成本， 在給動物提供優質蛋白的同時提高機體免疫力。本專利技術的總體的技術方案包括下列步驟Α、表達載體構建對目的基因進行核苷酸密碼子偏好性改造，利用基因直接合成方法，獲得待表達蛋白質編碼基因片段，將得到的基因片段克隆到表達質粒中，鑒定后通過電擊法轉入釀酒酵母菌株。B、表達質粒及重組菌株鑒定分別利用PCR、酶切、測序和表型誘導篩選，進行構建質粒和重組菌株的篩選鑒定。C、重組蛋白檢測使用SDS-PAGE和ELISA檢測重組蛋白及其表達量。D、酵母菌的培養保種的基因工程酵母菌株接種于SC選擇培養基上，于30°C倒置培養至單菌落長出后，挑取活化后的單菌落于YPD酵母菌完全液體培養基中過夜培養。E、酵母菌的誘導表達培養當過夜培養的新鮮菌液0D_=0.4時，1500*g離心 5min，收集菌體并用同樣體積的含半乳糖誘導劑的液體誘導培養基重懸，并于30°C、200r/ min振蕩培養。F、誘導時間確定新鮮菌液在添加誘導劑后的不同時間點分別測定重組蛋白數量，確定半乳糖添加量。G、發酵pH值的確定新鮮菌液在添加誘導劑后的不同時間點分別測定菌液的pH 值，并檢測重組蛋白數量，確定重組酵母發酵的最適pH。H、誘導劑添加量的優化新鮮菌液在添加誘導劑后的不同時間點分別測定重組蛋白數量，確定半乳糖添加量。I、重組蛋白活性檢測使用CPE試驗和利用IBDV-CEF系統檢測重組雞干擾素的抗病毒活性。本專利技術通過電擊法將經過改造的雞干擾素編碼基因ChIFN-α和ChIFN-Y導入飼料釀酒酵母菌株中，使其能夠作為生物反應器生產藥用蛋白雞干擾素。專利技術人利用INVScl 釀酒酵母菌株作為受體菌，經基因工程改造后得到雞干擾素重組基因工程菌株，經PCR、酶切鑒定、測序、SDS-PAGE、ELISA和CPE檢測，結果表明=ChIFN-α和ChIFN-Y基因整合到受體菌染色體基因組中，并得到正確的翻譯表達，重組菌株成功表達具有生物學活性的ChIFN 蛋白。酵母微生物發酵容易，產量大，自身具有營養和保健價值，與現有生產技術相比較，本專利技術將釀酒酵母作為生物反應器生產雞干擾素藥用蛋白，不僅可以極大降低干擾素生產成本，而且可以在提供優質蛋白的同時達到改善機體免疫功能的目的。附圖說明圖I為酵母表達載體pYE-IFNR的物理圖譜，利用氨芐青霉素(Amp)基因和URA3 (尿嘧啶合成酶)營養缺陷標記基因和作為篩選和標記基因。圖2酵母表達載體pYE-IFNG的物理圖譜，利用氨芐青霉素(Amp)基因和URA3 (尿嘧啶合成酶)營養缺陷標記基因和作為篩選和標記基因。圖3為YEChIFNR基因的菌落PCR檢測，PCR擴增獲得的條帶大小為582，與目標片段大小一致。其中M為DL2000DNA marker, 1-5為不同Amp抗性菌株。圖4為重組質粒pYE-IFNR酶切鑒定，使用Xho I /Kpn I雙酶切pYE_IFNR質粒后， 得到的片段與目標片段大小一致。其中M為DNAmarker，1-8為不同樣品。圖5為YEChIFNG基因的菌落PCR檢測，PCR擴增獲得的條帶大小為459，與目標片段大小一致。其中M1和M2為DNA marker, 1-16為不同Amp抗性菌株本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種人工合成的雞干擾素基因YEChIFNG，其核苷酸序列如SEQ?ID?NO2所示。
【技術特征摘要】
1.ー種人工合成的雞干擾素基因YEChlFNG，其核苷酸序列如SEQ ID N02所示。2.—種重組表達載體，具有權利要求I所述的人工合成的雞干擾素基因YEChlFNG，其骨架載體為PYES2/CT。3.—種重組工程菌，具有權利要求I所述的人工合成的雞干擾素基因YEChlFNG，所述受體菌為釀酒酵母菌株INVScl。4.權利要求3所述的重組工程菌生產藥用蛋白雞干擾素的方法，包括如下步驟 (1)、酵母菌的培養保種的重組工程菌接種于SC選擇培養基上，于30°C，200r/min過夜震蕩培養； (2)、酵母菌的誘導表達培養當過夜培養的新鮮菌液OD6tltl=O.3-0. 5時，離心收集菌體并用含半乳糖的液體誘導培養基重懸，并于30°C、200r/min振蕩培養。5.根據權利要求4所述的方法，所述步驟(2)的培養條件為誘導1...
【專利技術屬性】
技術研發人員：趙德剛，李義，宋莉，盧凌霄，
申請(專利權)人：貴州大學，
類型：發明
國別省市：
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