一種靈芝活性肽的制取方法技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)公開了一種靈芝活性肽的制取方法，以靈芝菌絲體粉為原料，經(jīng)水提取、超濾分離、活性炭脫色、Cu2+-SephadexG-25柱配位色譜分離、螯合樹脂脫銅、大孔樹脂脫鹽、冷凍干燥，獲得靈芝活性肽。本發(fā)明專利技術(shù)靈芝活性肽產(chǎn)品的肽含量達(dá)92％以上，具有保肝、抗氧化、抗疲勞、抑制腫瘤等功效。

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】

本專利技術(shù)屬于生物
，涉及，尤其是以靈芝菌絲體粉為原料，采用現(xiàn)代生物技術(shù)制取靈芝活性肽的方法。
技術(shù)介紹
靈芝屬于擔(dān)子菌綱，多孔菌目，多孔菌科靈芝屬植物。靈芝又稱為瑞草，俗稱“仙草”，日本人稱之為萬(wàn)年草。靈芝最早收載于東漢的《神農(nóng)本草經(jīng)》中，被列為上藥。所謂上藥，指在中藥或者復(fù)方里面可作為君藥，即主藥，認(rèn)為“主養(yǎng)命，以應(yīng)天”。而且毒性非常低， “多服，久服不傷人”。“益氣、輕身”，即要想身體好、抵抗力強(qiáng)、長(zhǎng)壽，應(yīng)該用上藥。靈芝有效成份非常豐富，其中主要有效成份有多糖、三萜類(靈芝酸)、蛋白質(zhì)類、腺苷類、生物堿及各種微量元素等。現(xiàn)代藥理學(xué)和臨床醫(yī)學(xué)研究表明，靈芝具有多種生理活性和極高的藥用價(jià)值。多肽是分子結(jié)構(gòu)介于氨基酸和蛋白質(zhì)之間的一類化合物，多肽和蛋白質(zhì)都是由氨基酸構(gòu)成，從氨基酸營(yíng)養(yǎng)的角度來(lái)分析，兩者是一樣的；但是多肽的分子量比蛋白質(zhì)小很多，而且有些具有蛋白質(zhì)所沒(méi)有的生理調(diào)節(jié)功能。作為基礎(chǔ)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，多肽比氨基酸更易吸收，生物利用率高。生物活性肽(Bioactivepeptides, BAP)是指能夠調(diào)節(jié)生物機(jī)體的生命活動(dòng)或具有某些生理活性作用的一類肽的總稱，又稱為功能肽。科學(xué)研究表明=BAP具有降低血壓、延緩衰老、抗氧化、保肝、美體養(yǎng)顏、抗疲勞、改善睡眠、增強(qiáng)記憶、抑制腫瘤、增強(qiáng)免疫、促進(jìn)人體對(duì)蛋白質(zhì)及各種有益微量元素的吸收等多種功效。BAP的開發(fā)應(yīng)用是當(dāng)前生物工程領(lǐng)域的熱門課題，廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥 、保健、食品、化妝品等行業(yè)，正在形成具有廣闊前景的新產(chǎn)業(yè)。20世紀(jì)80年代，國(guó)際上如日本、韓國(guó)、美國(guó)和歐洲等國(guó)家和地區(qū)都已經(jīng)有了專業(yè)的多肽經(jīng)營(yíng)企業(yè)進(jìn)行產(chǎn)業(yè)化運(yùn)作。目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于靈芝多糖及靈芝三萜類化合物的提取純化與藥理作用研究透徹， 然而對(duì)靈芝肽(GLP)的研究卻鮮有涉及。何云慶等從靈芝子實(shí)體熱水提取物中分離出兩種肽多糖，肽含量分別占26. 3%和12. 3%，分子量分別為12800Da和14100Da。何國(guó)亮等用硫酸-苯酚法和氨基酸分析儀測(cè)定了靈芝肽多糖，并計(jì)算了肽糖比。1979年湖南醫(yī)藥工業(yè)研究所201組首先發(fā)現(xiàn)靈芝肽具有提高人體耐缺氧能力的活性。他們以氨水作洗脫液，采用732型陽(yáng)離子樹脂分離靈芝發(fā)酵液的醇、水提取物，得到四個(gè)肽，兩個(gè)酸性肽(由11 種氨基酸組成)、一個(gè)堿性四肽和一個(gè)中性肽(9種氨基酸組成)，其中中性肽的活性最強(qiáng)。 1993年，董穎等先采用732型陽(yáng)離子樹脂，以3%氨水為洗脫液，從靈芝子實(shí)體的熱水、 乙醇提取物中分離得到粗肽，再通過(guò)DA-201大孔吸附樹脂柱，以O(shè). Olmol/L醋酸洗脫，除去粗肽中的色素。洗脫液經(jīng)濃縮后，上Sephadex G_15柱，以水為洗脫液將多肽與氨基酸和鹽分開；再采用DEAE-Cellulose柱進(jìn)一步分離，用NH4HCO3階段梯度洗脫得到5個(gè)肽，其中酸性肽和堿性肽各兩種，中性肽一種。研究表明，酸性肽及堿性肽均能有效清除氧自由基，從而保護(hù)紅細(xì)胞膜免遭氧化，延緩衰老。研究表明靈芝發(fā)酵液中的肽類具有較好的抑制羥基自由基，而含有靈芝肽的提取物(分子量小于I萬(wàn)部分)所表現(xiàn)出的抗S-180肉瘤的活性可能也與此有關(guān)。活性肽類化合物具有較強(qiáng)的生理活性，是中草藥治療癌癥、心腦血管疾病等疑難病癥的有效成分之一，因此對(duì)靈芝活性肽的深入研究具有重要的意義。本專利技術(shù)提供了一種靈芝活性肽的分離純化方法，為充分發(fā)揮靈芝活性肽的功效提供依據(jù)。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
本專利技術(shù)的目的在于解決現(xiàn)有技術(shù)缺陷，提供一種靈芝活性 肽的制取方法，為開發(fā)靈芝保健品和靈芝藥物提供依據(jù)。本專利技術(shù)的技術(shù)方案是以靈芝菌絲體粉為原料，經(jīng)水提取、超濾分離、活性炭脫色、 Cu2+-SephadexG-25柱配位色譜分離、螯合層析柱脫銅、大孔樹脂脫鹽、冷凍干燥，獲得靈芝活性肽，包括如下步驟1.靈芝菌絲體粉的水提取用蒸餾水于室溫下，按1: 3-5 (W V)的料液比浸提靈芝菌絲體粉2-3次，每次 4_6h02.超濾分離采用截留分子量為IOOOODa的中空纖維膜對(duì)靈芝菌絲體粉水提液進(jìn)行超濾分離， 得到含氨基酸、肽類及小分子糖等低分子化合物的超濾液。3.活性炭脫色超濾液中加入1-3%的活性炭充分吸附,過(guò)濾,5000rpm離心10_20min。4.葡聚糖凝膠配位色譜分離取一定量的脫色超濾液上Cu2+-S印hadexG-25柱(Φ L 6X70cm)，用硼砂緩沖液 (pH值11，50mmol/L)以O(shè). 2-0. 3mL/min的流速洗脫，收集Cu-肽螯合物洗脫液。本專利技術(shù)采用Cu2+-S印hadexG-25柱可有效地將靈芝活性肽分離，其分離原理是銅可與葡聚糖、氨基酸、肽形成穩(wěn)定性不同的螯合物，其中Cu-肽螯合物的穩(wěn)定性最強(qiáng)，Cu-氨基酸螯合物與Cu-葡聚糖凝膠螯合物的穩(wěn)定性相當(dāng)，當(dāng)含有氨基酸和肽的溶液流經(jīng)以 Cu-葡聚糖凝膠為固定相的層析柱時(shí)，形成穩(wěn)定性強(qiáng)的螯合物的肽優(yōu)先奪取Cu-葡聚糖凝膠螯合物中的Cu2+，以Cu-肽螯合物的形式流出，而糖類化合物不能與銅形成螯合物，故肽也能與糖類化合物分離，得到的肽的純度較高，此方法的重現(xiàn)性很好，上樣體積大，是一種較理想的分離靈芝活性肽的方法。5.螯合樹脂脫銅調(diào)節(jié)Cu-肽螯合物洗脫液的pH值為5-7，上D401螯合樹脂柱，用O. 1-0. 5mol/LHCl 洗脫去Cu2+。螯合樹脂是一類能與金屬離子形成多配位絡(luò)合物的交聯(lián)功能高分子材料。D401螯合樹脂為氨基羧酸類樹脂，其帶有的亞氨基二乙酸基可與二價(jià)金屬離子形成穩(wěn)定的螯合結(jié)構(gòu)，具有與金屬結(jié)合能力強(qiáng)、吸附容量高、操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)。本專利技術(shù)采用D401螯合樹脂，可簡(jiǎn)便、高效地去除Cu-肽螯合物中的Cu2+，去除率可達(dá)90%以上。6.大孔樹脂脫鹽采用大孔吸附樹脂DA201-C吸附脫鹽，上樣流速為1. 5-2. OmL/min, pH值為5. 5， 上樣濃度為1. 5-2. 5mg/mL, 2-3倍柱床體積的70%乙醇洗脫，收集洗脫液。經(jīng)配位色譜分離得到的靈芝活性肽，由于采用pH值11. O的硼酸鹽作為洗脫液，因此要對(duì)靈芝活性肽的硼砂洗脫液進(jìn)行脫鹽處理，本專利技術(shù)采用大孔樹脂DA201-C脫鹽，處理量小于或等于樹脂用量的3/4時(shí)，可以達(dá)到100%的吸附率而不發(fā)生穿透，采用70%乙醇洗脫，靈芝活性肽的洗脫率達(dá)到98%以上，脫鹽率達(dá)到95%以上。7.冷凍干燥脫鹽后的洗脫液經(jīng)冷凍干燥，得到靈芝活性肽(GLP)，肽含量達(dá)92%以上。目前，國(guó)內(nèi)外研究靈芝的現(xiàn)狀是對(duì)靈芝多糖、三萜類化合物的研究較為深入，而關(guān)于靈芝小分子肽的研究報(bào)道比較少。本專利技術(shù)工藝簡(jiǎn)單，靈芝活性肽產(chǎn)品的肽含量達(dá)92% 以上，具有保肝、抗氧化、抗疲勞、抑制腫瘤等功效，可作為生產(chǎn)靈芝保健品和靈芝藥物的組分。附圖說(shuō)明附圖1是以靈芝菌絲體粉為原料，經(jīng)水提取、超濾分離、活性炭脫色、 Cu2+-SephadexG-25柱配位色譜分離、螯合層析柱脫銅、大孔樹脂脫鹽、冷凍干燥，獲得靈芝活性肽的工藝流程圖。具體實(shí)施方式以下實(shí)施例用于說(shuō)明本專利技術(shù)，但不用來(lái)限制本專利技術(shù)的范圍。 實(shí)施例1.1.靈芝菌絲體粉的水提取用蒸餾水于室溫下，按1: 3(W : V)的料液比浸提靈芝菌絲體粉2次，每次4h。2.超濾分離采用截留分子量為IOOOODa的中空纖維膜對(duì)靈芝菌絲體粉水提液進(jìn)行超濾分離， 得到含氨基酸、肽類及小分子糖等低分子化合物的超本文檔來(lái)自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種靈芝活性肽的制取方法，其特征在于：以靈芝菌絲體粉為原料，經(jīng)水提取、超濾分離、活性炭脫色、Cu2+?SephadexG?25柱配位色譜分離、螯合樹脂脫銅、大孔樹脂脫鹽、冷凍干燥等工藝處理后，獲得靈芝活性肽。

【技術(shù)特征摘要】

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：王秀英，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：西藏金稞集團(tuán)有限責(zé)任公司，
類型：發(fā)明
國(guó)別省市：