一種環氧水解酶突變體及其基因和應用制造技術

本發明專利技術公開了一種環氧水解酶突變體及其基因和應用。該環氧水解酶突變體是在具有如序列表中SEQ?ID?No:1所示氨基酸序列的蛋白質的第123位、128位、144位、145位、168位、219位和第221位氨基酸中的一位或多位經過取代一個氨基酸且具有環氧水解酶活性的由其衍生的蛋白質。本發明專利技術所述環氧水解酶突變體與野生型環氧水解酶相比，對消旋環氧化物的水解活性和對映選擇性均有大幅度提高，所述環氧水解酶突變體尤其適合拆分催化消旋萘基縮水甘油醚拆分反應，制備(S)-萘基縮水甘油醚，并可進一步合成手性藥物(S)-普萘洛爾，該水解酶突變體具有很好的工業應用前景。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術屬于生物工程
，具體涉及ー種環氧水解酶突變體及其基因和應用。
技術介紹
生物催化是ー個由有機化學、生物化學、微生物學和過程工程學等多個學科交叉的研究領域。生物催化劑具有高效、特異的催化活力，其最大優勢在于無可比擬的化學選擇性和立體選擇性，在酶的作用下，產物的光學純度可高達99%ee，在醫藥中間體合成中顯得尤為重要。生物催化的反應條件很溫和，適宜在常溫常壓、中性PH和水相中進行反應，這與“可持續發展”、“綠色化學”、“環境友好制造”等エ業發展的目標相符。生物催化技術已被看 作是對傳統生物發酵與化學合成產業改造極為重要的、很有吸引力的技術之一。目前已實現エ業化的生物轉化過程中，水解酶由于其高活性和穩定性以及不需要額外添加輔因子等優點成為主要的一大類應用于有機合成的生物催化劑，大約占生物催化劑總量的44%，而其中的大部分水解酶應用于手性化合物的合成(參見Curr. Org.Chem. 2010，14，1447-1460)。在大量的手性化合物中，手性環氧化物是ー類非常重要的手性合成砌塊，由于環氧化物及其開環產物鄰ニ醇能與各種親核試劑反應，因而廣泛應用于手性藥物、農藥、液晶、香料以及其他手性化學品的合成。通過化學法或生物法催化外消旋環氧化物的動力學拆分可以制備光學活性環氧化物。其中環氧水解酶是用于高光學活性手性環氧化物和手性ニ醇制備的ー類重要的生物催化劑。它具有以下一些優點1)酶的來源廣泛、底物譜廣、選擇性高；2)反應不需要添加任何輔因子；3)環氧水解酶在非水相介質中仍能保留一定活性；4)反應條件溫和，無污染，符合“緑色化學”趨勢；5)具有對映選擇性和位置選擇性互補的環氧水解酶可實現對映歸ー性水解，理論上能以100%的轉化率獲得單一構型的光學純鄰位ニ醇，具有很高的原子經濟性，因此該方法在光學純的環氧化物或鄰位ニ醇制備中具有很高的應用潛力。目前市場上已有來源于黑曲霉(Aspergillrs niger)和紅平紅球菌(Rhodococcuserythropolis)的環氧水解酶實現了商品化酶制劑的銷售(Sigma)。然而真正實現エ業化的環氧水解酶應用實例還很少，許多重要的環氧化合物找不到合適的環氧水解酶進行拆分。一大類重要的心血管藥物-洛爾類藥物(也稱P-blocker，￠-腎上腺素阻斷劑)，發揮功能的主要是它們的(S)-對映體，而(R)-對映體不具備藥理活性甚至會產生副作用，如普萘洛爾的(S)-對映體的藥理活性是(R)-對映體藥理活性的130倍(參見Br. J.Pharmacol. 1968，34，13-55)。洛爾類藥物可通過其相應構型的環氧化物作為前體合成得至IJ，如(S)-普萘洛爾可通過(S)-萘基縮水甘油醚作為前體合成得到。但由于洛爾類藥物的合成前體往往分子結構比較大，因此具有較大的空間位阻，目前已發現的環氧水解酶對它們的活性和選擇性往往很低。從巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium) CGMCC1293克隆得到的環氧水解酶BmEH可催化多種縮水甘油芳基醚的對映選擇性水解拆分制備高光學活性的手性環氧化物，該酶已經在大腸桿菌(Escherichia coli)中重組過量表達(Adv. Synth. Catal. 2011, 353, 1510-1518;CN102242085A)。該酶對苯基縮水甘油醚底物具有高達83U/mg純酶的比活力，并且優先催化(R)-構型底物水解。對于萘基縮水甘油醚，由于其苯環上有大取代基團的底物，因此該重組酶對該底物的活性和選擇性較低，活性不足lU/mg純酶，從而限制了它在高附加值藥物前體的手性合成中的應用潛力。通過解析環氧水解酶的晶體結構，并利用分子動カ學模擬等手段，從分子水平解析酶的催化過程，通過定點突變技術提高環氧水解酶對目標底物的催化活性和選擇性，將具有較強的エ業應用價值。
技術實現思路
因此，本專利技術所要解決的技術問題是，針對目前已發現的環氧水解酶對萘基底物的催化活性和選擇性都較低的問題，提供一種環氧水解酶突變體蛋白質及其基因，含有該基因的重組表達載體和重組表達轉化體，所述環氧水解酶突變體蛋白質、含有該環氧水解酶突變體蛋白質的細胞的制備方法，以及該環氧水解酶突變體蛋白質或表達該環氧水解酶突變體蛋白質的重組轉化體作為催化劑在催化消旋環氧化物水解拆分反應，制備光學純手性化合物中的應用。與野生型環氧水解酶相比，本專利技術提供的環氧水解酶突變體蛋白質具有更高的催化底物反應活性和選擇性。為解決上述技術問題，本專利技術采取的技術方案之ー是一種分離的蛋白質，所述蛋白質是在具有如序列表中SEQ IDNo:1所示氨基酸序列的蛋白質的第123位、128位、144位、145位、168位、219位和第221位氨基酸中的一位或多位經過取代ー個氨基酸且具有環氧水解酶活性的由其衍生的蛋白質。其中所述蛋白質的制備方法為本領域常規制備方法。所述制備方法較佳地為從自然界中天然存在的蛋白質中分離獲得，從重組表達該蛋白質的表達轉化體中分離獲得或者通過人工合成蛋白質序列獲得。具有序列表中SEQ ID No:1所不氣基酸序列的蛋白質命名為BmEh蛋白。其中所述的取代的位點較佳地為序列表中SEQ ID No:l所示氨基酸序列的第123位、128位、144位、145位、168位、219位和第221氨基酸中的一位或多位。其中所述蛋白質較佳地為將具有序列表中SEQ IDNo:1所不氣基酸序列的蛋白質的第98位的色氨酸突變為苯丙氨酸(W98F);所述氨基酸序列中第101位的甘氨酸突變為亮氨酸(GlOlL);所述氨基酸序列中第123位的脯氨酸突變為色氨酸(P123W);所述氨基酸序列中第128位的苯丙氨酸突變為丙氨酸(F128A)、纈氨酸(F128V)或異亮氨酸 (F128I)，其中更佳地是突變為纈氨酸(F128V);所述氨基酸序列中第132位的亮氨酸突變為丙氨酸(L132A);所述氨基酸序列中第144位的酪氨酸突變為苯丙氨酸(Y144F);所述氨基酸序列中的第145位的甲硫氨酸突變為丙氨酸(M145A)、纈氨酸(M145V)、異亮氨酸(M145I)、亮氨酸(M145L)、半胱氨酸(M145C)、蘇氨酸(M145T)或組氨酸(M145H)，其中更佳地是突變為丙氨酸(M145A);所述氨基酸序列中第168位的亮氨酸突變為丙氨酸(L168A)；所述氨基酸序列中第169位的纈氨酸突變為苯丙氨酸(V169F);所述氨基酸序列中第203位的酪氨酸突變為苯丙氨酸(Y203F);所述氨基酸序列中第206位的亮氨酸突變為丙氨酸(L206A);所述氨基酸序列中第208位的異亮氨酸突變為丙氨酸(I208A);所述氨基酸序列中第219位的亮氨酸突變為丙氨酸(L219A);所述氨基酸序列中第220位的苯丙氨酸突變為丙氨酸(F220A);所述氨基酸序列中第221位的脯氨酸突變為甘氨酸(P221G);所述氨基酸序列中第242位的苯丙氨酸突變為丙氨酸(F242A);所述氨基酸序列中第268位的丙氨酸突變為苯丙氨酸(A268F)所得的蛋白質。本專利技術所述蛋白質的制備方法為本領域常規制備方法。所述制備方法較佳地為將編碼所述蛋白質并且帶有點突變的核酸分子克隆到重組載體中，將所得重組載體轉化到轉化體中，得到重組表達轉化體，通過培養所得重組本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種分離的蛋白質，其特征在于，所述蛋白質是在具有如序列表中SEQ?ID?No:1所示氨基酸序列的蛋白質的第123位、128位、144位、145位、168位、219位和第221位氨基酸中的一位或多位經過取代一個氨基酸且具有環氧水解酶活性的由其衍生的蛋白質。

【技術特征摘要】
1.一種分尚的蛋白質，其特征在于，所述蛋白質是在具有如序列表中SEQ ID No:1所不氨基酸序列的蛋白質的第123位、128位、144位、145位、168位、219位和第221位氨基酸中的一位或多位經過取代一個氨基酸且具有環氧水解酶活性的由其衍生的蛋白質。2.如權利要求1所述的蛋白質，其特征在于所述蛋白質的氨基酸序列中第123位的脯氨酸突變為色氨酸；所述蛋白質的氨基酸序列中第128位的苯丙氨酸突變為丙氨酸、纈氨酸或異亮氨酸； 所述蛋白質的氨基酸序列中第144位的酪氨酸突變為苯丙氨酸；所述蛋白質的氨基酸序列中第145位的甲硫氨酸突變為丙氨酸、半胱氨酸、組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、蘇氨酸或纈氨酸；所述蛋白質的氨基酸序列中第168位的亮氨酸突變為丙氨酸；所述蛋白質的氨基酸序列中第219位的亮氨酸突變為丙氨酸；所述蛋白質的氨基酸序列中第221位的脯氨酸突變為甘氨酸。3.一種分離的核酸，其特征在于，所述核酸是編碼如權利要求1所述蛋白質的核酸分子。4.一種包含如權利要求3所述的核酸的重組表達載體。5.一種包含如權利要求4所述的重組表達載體的重組...

【專利技術屬性】
技術研發人員：孔旭東，許建和，周佳海，潘江，
申請(專利權)人：華東理工大學，中國科學院上海有機化學研究所，
類型：發明
國別省市：