本發明專利技術提供制備重配病毒的方法，其中血凝素和神經氨酸酶基因的轉錄和/或翻譯被抑制。
【技術實現步驟摘要】
【國外來華專利技術】
本專利技術屬于流感病毒重配領域。另外，其涉及抗流感病毒感染的疫苗制造。
技術介紹
抗流感感染的最有效的保護是接種抗流行毒株的疫苗，而且重要的是要盡快生產用于制造疫苗的流感病毒。野生型流感病毒在蛋和細胞培養物中通常生長緩慢。為了獲得用于疫苗生產的較快生長的毒株，目前常用的實踐是用較快生長的高產率骨架株與流行的流感毒株(本文 中稱為疫苗株)重配。可如下實現重配用疫苗株和骨架株在細胞培養物或胚胎蛋的羊膜水中共同感染細胞。然后加入骨架株的血凝素(HA)和神經氨酸酶(NA)蛋白特異性抗體來阻滯攜帶骨架株的(HA)和(NA)蛋白的流感病毒復制。該處理經數次傳代可選到快速生長的重配流感病毒，所述病毒包含來自疫苗株的HA和NA區段和來自骨架株的其它病毒區段(即那些編碼 PBl、PB2、PA、NP、Ml、M2、NSl 和 NS2 的區段)。目前的方法有若干缺點。例如，從得到一種新流感毒株至獲得最終高速生長重配株通常需要約35天，這導致流感病毒生產的延遲。另外，需要將病毒傳代數次，增加了 HA抗原中發生突變的風險，這導致不需要的抗原性改變。用多克隆抗血清抑制非重配病毒增殖還會增加引入外來病毒因子和其它污染物的風險。本專利技術的目的是提供生產重配流感病毒的進一步并改進的方法。優選實施方式概述專利技術人目前已意外地發現，在病毒生產中優先降低骨架株的HA和/或NA基因轉錄和/或翻譯(例如通過采用RNA抑制)可大幅度提高重配病毒的產生速度。所述方法還具有不依賴使用抗體并因此避免使用動物衍生產品的優點。另外，由于為獲得重配病毒所需的傳代次數減少，自發性突變的可能性降低。本專利技術提供一種制備重配流感病毒的方法，所述方法包括步驟(i )用第一流感毒株和第二流感毒株感染培養宿主；(ii )用抑制劑接觸步驟(i )的培養宿主，其中所述抑制劑優先降低(i)中流感毒株中一種的血凝素和/或神經氨酸酶基因的轉錄和/或翻譯；(iii)培養所述培養宿主以產生重配病毒，并任選地(iv )純化步驟(iii)中獲得的病毒。本專利技術所述的方法還可包括以下步驟(V )用步驟(iii )或步驟(iv )中獲得的重配病毒感染培養宿主；(vi)培養來自(V )中的宿主來產生更多的病毒；并且任選地(vii)純化步驟(vi )中獲得的病毒。本專利技術提供一種制備重配流感病毒的方法，所述方法包括步驟(i )用具有至少一個靶區段的第一流感病毒株感染培養宿主；(ii )將編碼來自第二流感病毒株的靶區段的一個或多個表達構建體引入所述培養宿主；(iii)用抑制劑接觸所述培養宿主，其中所述抑制劑優先降低第一流感毒株的靶區段的轉錄和/或翻譯；(iv )培養所述培養宿主以產生重配病毒；并且任選地(V )純化步驟(iv )中獲得的病毒。本專利技術提供一種包含編碼以下區段的表達構建體的細胞(i )第一甲型或乙型流感病毒基因組的所有八個病毒區段；(ii )第二甲型或乙型流感病毒基因組的至少一個靶區段，其中第二流感毒株的靶區段序列不同于第一流感毒株的靶區段；和(iii)抑制劑，其中所述抑制劑優先降低第一流感毒株的靶區段的轉錄和/或翻譯。本專利技術還提供了一種制備重配流感病毒的方法，所述方法包括培養該細胞以產生重配病毒的步驟。所述方法還可包括以下步驟用從所述細胞獲得的重配病毒感染培養宿主，然后培養所述宿主來產生更多的病毒，繼而(任選地)純化用該途徑獲得的更多的病毒。 本專利技術還提供一種生產流感病毒的方法，所述方法包括以下步驟(a)用以本專利技術所述方法獲得的重配病毒感染培養宿主；(b)培養來自步驟(a)的宿主以產生病毒；并任選地(C)純化步驟(b)中獲得的病毒。本專利技術還提供了一種制備疫苗的方法，所述方法包括步驟(d)通過上述任一個實施方式的方法制備病毒，和(e)用該病毒制備疫苗。流感毒株流感病毒為分區段的負鏈RNA病毒。甲型和乙型流感病毒具有八個區段(PB2、PBl、PA、HA、NP、NA、M和NS)，而丙型流感病毒則具有七個區段(不含NA區段)。所述病毒至少需要四種病毒蛋白(PB1、PB2、PA和核蛋白)的存在才能啟動基因組復制。本專利技術所述方法采用流感骨架株和疫苗株。所采用的骨架株和疫苗株通常具有一個或多個(例如2、3、4、5、6、7或8個)病毒區段的不同，其可被下文所述的抑制劑差異性抑制。骨架株的所需區段相比疫苗株被更多地抑制，由此有利于重配株的生產。疫苗株可以是大流行性和大流行間期性(季節性)流感毒株。所述疫苗株可包含甲型流感病毒 HA 亞型 H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15 或H16。它們可包含甲型流感病毒NA亞型N1、N2、N3、N4、N5、N6、N7、N8或N9。所述疫苗株為季節性流感毒株時，疫苗株可具有Hl或H3亞型。本專利技術一方面中的所述疫苗株為HlNl或H3N2 株。所述疫苗株也可以是大流行性毒株或潛在的大流行性毒株。可能會引起大流行爆發的流感毒株特征是(a)相比目前流行的人毒株中的血凝素，其含有新血凝素，即十年來未在人群中被證實過的血凝素(如H2)，或之前在人群中完全不曾發現的血凝素(如H5、H6或H9，通常只在鳥群中發現)，以至人群對該毒株的血凝素沒有免疫力；(b)其能在人群中平行傳播；并且(C)其對人有致病性。當所述重配病毒用于產生對大流行性流感(例如H5N1株)免疫的疫苗時，優選含有H5血凝素型的疫苗株。其它可能的毒株包括H5N3、H9N2、H2N2、H7N1和H7N7，以及任何其它可能出現的大流行性毒株。本專利技術尤其適用于制備用于預防潛在大流行性毒株疫苗中的重配病毒，所述潛在的大流行性毒株能夠或已經從非人類的動物群傳播到人類，例如豬一源HlNl流感毒株。所述骨架株可以是任何已知流感病毒株，但優選在細胞和/或蛋的尿囊液中快速生長的流感病毒株。該優選的原因是制備重配流感病毒通常是為獲得用于疫苗生產的快速生長流感病毒。此類骨架株的示例包括但不限于A/Puerto Rico/8/34、A/Ann Arbor/6/60和 B/Ann Arbor/1/66。根據本專利技術制備的重配甲型流感病毒可包括來自A/PR/8/34病毒的一個或多個RNA區段(通常6個區段來自A/PR/8/34，HA和NA區段來自疫苗株，即6:2重配)。也可包括來自A/WSN/33病毒或來自在產生用于疫苗制劑的重配病毒中有用的任何其它病毒株的一個或多個RNA區段。重配甲型流感病毒可包括來自AA/6/60流感病毒(A/Ann Arbor/6/60)的少于6個(即1、2、3、4或5個)病毒區段。重配乙型流感病毒可包括來自AA/1/66流感病毒(B/Ann Arbor/1/66)的少于6個(即1、2、3、4或5個)病毒區段。 本專利技術所述的重配流感病毒株可包括來自A/California/4/09株的一個或多個基因組區段，優選HA區段和/或NA區段(由于這些區段為主要疫苗抗原)。因此，例如，HA基因區段可編碼相比SEQ ID N0:8而言，與SEQ ID NO:7更密切相關的Hl血凝素(即使用相同算法和參數，其相比SEQ ID N0:8而言，與SEQ ID NO:7有更高程度的序列相同性)。SEQ ID N0:7和8的相同性為80%。相似地，NA基因可編碼相比SEQ I本文檔來自技高網...
【技術保護點】
【技術特征摘要】
【國外來華專利技術】...
【專利技術屬性】
技術研發人員：H·特魯賽姆，P·馬森，M·弗蘭蒂，B·基納，M·賽克卡，J·恒茨克，D·莫里西，F·JC·拿塔，
申請(專利權)人：諾華有限公司，
類型：
國別省市：
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