結直腸癌特異性的基因-病毒治療藥物制造技術

本發明專利技術公開了一種結直腸癌特異性的基因-病毒治療藥物。使用腺病毒，其早期基因E1A的天然啟動子被結直腸癌特異性啟動子CEA等取代，構成一種溶瘤腺病毒，后者攜帶結直腸癌特異的抗癌基因ST13，如其抗癌作用還不夠強，不足以基本全部消滅癌癥，則可在同一載體上加上下述基因與之共用，如TRAIL、IL-24、MnSOD、CD、Smac、GM-CSF、IFN、IL-12、p53、RNAi、microRNA、Caspase?3及Bax，或采用將兩個基因用各種方案連接起來使用。本發明專利技術為結直腸癌特異性基因-病毒治療的藥物，具有很高靶向結直腸癌的治療作用，對正常細胞基本無影響。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術屬于癌癥的革巴向基因-病毒治療(Cancer Targeting Gene-Viro-Therapy,CTGVT)領域，具體涉及結直腸癌特異性的靶向基因-病毒治療(CancerTargetingGene-Viro-Therapy Specific for Colorectal Cancer, CTGVT-CRC),更具體的，是關于一種結直腸癌特異性基因-病毒治療藥物。
技術介紹
1999-2001年，劉新垣創建了一種癌癥治療策略，叫癌癥的靶向基因-病毒治療(Cancer Targeting Gene-Viro-Thearpy, CTGVT),它是將抗癌基因插入到溶瘤病毒(oncolytic virus, 0V)而成，故 CTGVT 策略即 OV-(gene)策略或 Gene ArmedOncolyticVirus Therapy (GAOVT)策略，后者也是OV-(gene)，CTGVT (GAOVT)把基因治療和溶瘤病毒治療各自的優勢結合起來了，因為溶瘤病毒本身就有抗癌作用，又可能特異性地在癌細胞中復制數百倍，插入其中的抗癌基因也可隨之復制數百倍，故其抗癌效果大大地增加，既比相應單獨基因治療好很多，也比相應單獨溶瘤病毒治療好很多，故現在成為國際熱點課題。基因治療，雖然2009年被Science評為全球十大科學成果之一，但那都是對單基因缺乏的遺傳病所獲得的成果，對癌癥這樣復雜又是多基因突變的疾病，基因治療的抗癌效果，遠不如CTGVT(GAOVT)的抗癌效果，基因治療為Ad-(gene)，其中所用的載體Ad無癌癥靶向性，在癌細胞中無復制能力(即非復制型Ad)，故其抗癌效果，遠遠不如CTGVT。如圖5所示，腺病毒有早期基因有El、E2、E3、E4及晚期基因L1、L2、L3、L4、L5。其中El又可分為E1A、E1B，最重要的是E1A，其次是E1B。ElA的天然啟動子被結直腸癌特異性的啟動子替換，則此腺病毒只能在結直腸癌細胞中感染復制。溶瘤病毒(Oncolytic Virus，0V)，是指在腫瘤中特異表達和感染復制的病毒，有癌細胞IE向性，還能復制，但非結直 腸癌特異性。任何病毒(Adenovirus (腺病毒),SimplexHerpes Virus (HSV-1)(皰疫病毒)，Poxvirus (痘苗病毒))經改造后均可構成為0V。溶瘤病毒攜帶gene則為0V-gene,但Ad-gene即基因治療(其中Ad無祀向性,無復制倍增能力)。
技術實現思路
在CTGVTJP ov-(gene)的構建與應用中，OV(Oncolytic Virus)主要決定其靶向性，可用各式各樣的方法加以構建，使它產生不同靶向性，本申請只涉及特異性靶向結直腸癌領域，目的是提供一種結直腸癌特異性的基因-病毒治療藥物，CTGVT-CRC及其應用。Gene主要決定殺傷性，光OV的殺傷作用有限，故需加殺傷基因以增強其抗癌作用，構成OV-(gene)，即CTGVT (GAOVT)，才能構成很強的抗癌藥物，對CTGVT還需要更多改進，如將兩個CTGVT合用，其抗癌作用更強，常可把移植性腫瘤基因基本上消滅光。此外，如專門靶向癌癥干細胞，則有根除癌癥和徹底消滅癌癥的可能性。本專利技術具體采用如下技術方案本專利技術是用結直腸癌特異性啟動子CEA替換ElA本身的天然啟動子，則此腺病毒變成了對結直腸癌特異性溶瘤腺病毒，可簡寫為(CRC) ^ncoAd,即一種靶向結直腸癌的OV載體，這是本專利的根本要求，此外，對ElB的表達也可改造，如缺失其中55KD，則為ElB (Δ 55), Δ為缺失之意，稱ZD55，也可寫成D55 ;Ε1Β有兩個基因，即19KD與55KD基因，如這兩個基因雙缺失則為ΛΕ1Β。Ad ·Ε1Β的天然啟動子也可用HIF(低氧誘導因子)取代，構成Ad · HIF · Ε1Β，總的要求是構成Ad · CEA · ElA · ^ ElB ( ^ Ε1Β，表示可對ElB進行的任意改造)。至于基因方面，對結直腸癌來說，或者加入結直腸癌特異性抑癌基因，如ST13，構成Ad · CEA · ElA · D55_(ST13),如抗癌能力還不夠強，還可在同樣載體上加用抗癌作用很強但無專一性的抗癌基因如TRAIL，構成Ad · CEA · ElA · D55-(TRAIL)與上述帶ST13的CTGVT-CRC合用，則可取得更好的抗癌效果。除TRAIL外，也可用IL-24、MnSOD, Smac,GM-CSF、IFN、IL-12、p53、RNA1、microRNA、Caspase 3,Bax 等等，使用兩個基因時，其中必有一個為結直腸特異性的抗癌基因，兩個基因可用如下方法構建A.使用兩個重組子，分別各帶一個抗癌基因—個重組子中分別用兩個基因表達框表達；C.兩個基因用連接子連接起來。如用F · 2A或IETD四個氨基酸。在本專利技術的第一個方面，提供一種結直腸癌特異性的基因-病毒治療藥物，即CTGVT-CRC，其特征在于，所述藥物是將結直腸癌特異的抗癌基因插入到結直腸癌特異的溶瘤病毒中而制成。所述溶瘤病毒為溶瘤腺病毒，早期基因El分為E1A、E1B，E1A的啟動子被結直腸癌特異性啟動子取代。根據本專利技術，所述結直腸癌特異性啟動子為結直腸癌特異性啟動子CEA或其它結直腸癌特異的啟動子。根據本專利技術，首先是結直腸癌特異的抗癌基因，如ST13，也可增加其它抗癌效果很好的抗癌基因，如 TRAIL、IL-24、MnS0D、CD、Smac、GM-CSF、IFN、IL-12、p53、RNA1、microRNA、Caspase 3、或Bax等，使用兩個基因，但其中必需有結直腸特異性基因如ST13。如果是兩個抗癌基因，相互之間可用不同方式聯合使用，所述方式為A、用兩個重組子；B、在一個重組子中帶有兩個基因的表達框；或C、兩個基因用聯接子連接起來加到一個載體中(即為一個表達)，連接子可為F · 2A或IETD四個氨基酸。根據本專利技術，所述ElB可進行如下改造(1)、所述ElB的天然啟動子被HIF取代；(2)、刪除 ElB 中的 55KD ;(3)、刪除 ElB 中的兩個基因 19KD 和 55KD(AE1B)。本專利技術為結直腸癌特異性基因-病毒治療的藥物，具有很高靶向抗結直腸癌的治療作用，對正常細胞基本無影響。附圖說明圖1A顯示了 Ad · (ST13) · CEA · ElA (Δ 24)的構建原理框架圖。圖1B 顯示了 Ad · (ST13) · CEA · Ε1Α(Δ 24)的具體構建過程。圖1C為Ad · (ST13) · CEA · ElA(Δ 24)的鑒定，用PCR，使用CEA啟動子兩端的引物得到424bp。圖1D為Ad· (ST13) · CEA · ElA ( Λ 24)的鑒定，用PCR，使用ST13兩端的引物得到IllObp0圖2A為帶雙基因CTGVT-CRC的構建原理。圖2B為帶雙基因CTGVT-CRC的具體構建過程。圖3A 顯示了 Ad · (ST13) · CEA · ElA (Δ 24)的劑量依賴性體體外(in vitro)抗癌效果。圖3B 顯示了 Ad · (ST13) · CEA · ElA (Δ 24)的時間依賴性體體外(in vitro)抗癌效果。本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種結直腸癌特異性的基因?病毒治療藥物，即CTGVT?CRC(ColorectalCancer)，其特征在于，所述藥物是將結直腸癌特異的抗癌基因插入到結直腸癌特異性的溶瘤病毒中而制成。

【技術特征摘要】
1.一種結直腸癌特異性的基因-病毒治療藥物，即CTGVT-CRC(ColorectalCancer)，其特征在于，所述藥物是將結直腸癌特異的抗癌基因插入到結直腸癌特異性的溶瘤病毒中而制成。2.如權利要求1所述的結直腸癌特異性的基因-病毒治療藥物，其特征在于，所述結直腸癌特異性啟動子可為CEA，或其它結直腸癌特異的啟動子。3.如權利要求1所述的結直腸癌特異性的基因-病毒治療藥物，其特征在于，所述抗癌基因為結直腸癌特異的ST13。4.如權利要求3所述的結直腸癌特異性的基因-病毒治療藥物，如抗癌能力還不夠強，可在同一載體中加上其它如下抗癌基因與之共用如 TRAIL、IL-24、MnSOD, C...

【專利技術屬性】
技術研發人員：劉新垣，楊敏，周秀梅，謝國良，
申請(專利權)人：中國科學院上海生命科學研究院，
類型：發明
國別省市：