本發(fā)明專利技術(shù)公開了基于谷子全基因組序列開發(fā)的SSR核心引物組及其應(yīng)用，屬于分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。所述核心引物組，包括30對引物，其核苷酸序列如序列表SEQ?ID?No.1～60所示。上述引物具有分布均勻、擴(kuò)增穩(wěn)定、電泳條帶清晰、多態(tài)性豐富的優(yōu)點。本發(fā)明專利技術(shù)還提供了SSR核心引物組在谷子遺傳多樣性和品種鑒定中的應(yīng)用。該組引物能準(zhǔn)確快速鑒定谷子品種，準(zhǔn)確反映谷子品種間的遺傳關(guān)系。
【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)涉及谷子SSR標(biāo)記，具體地說是基于谷子全基因組序列開發(fā)的SSR核心引物組及其應(yīng)用，屬于分子生物學(xué)
技術(shù)介紹
谷子(SetariaItalica Beauv.)屬禾本科(Gramineae)狗尾草屬[Setaria (L.)Beauv.]，是中國起源的世界最古老作物和中華民族的哺育作物，曾經(jīng)為中國革命和新中國初期的吃飯問題起過非常重要的作用，也是當(dāng)時的戰(zhàn)略儲備糧食。谷子營養(yǎng)價值豐富，富含維生素A、E，人體必需氨基酸中的蛋氨酸為八一粉的118倍、大米的2125倍，具有良好的保健作用，可開發(fā)、加工成一系列食用方便的食品。谷類籽粒蛋白質(zhì)還具有抗動脈粥樣硬化的作用。谷子屬C4植物，具有耐旱、耐鹽、耐瘠薄、高光合作用效率等特性，是開展作物抗旱機(jī)理及C4光合系統(tǒng)發(fā)育與調(diào)控研究的新模式作物，也是應(yīng)對氣候變暖和干旱形勢的戰(zhàn)略儲備作物，是國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)的重要組成部分。我國作為谷子的主產(chǎn)國，對于谷子新品種培育和產(chǎn)量發(fā)展具有重要的意義。近五年來，我國各省新培育品種呈現(xiàn)良好的發(fā)展勢頭，培育出大量新品種。隨著植物育種和種子貿(mào)易的發(fā)展，植物新品種保護(hù)的重要性日益突出。準(zhǔn)確、快速進(jìn)行農(nóng)作物品種的鑒定，對于農(nóng)作物品種審定、品種保護(hù)、真假品種辨別、品種的產(chǎn)權(quán)糾紛等方面均有重要作用。植物新品種測試，又稱DUS測試，是對申請保護(hù)的植物新品種進(jìn)行特異性(Distinctness)、一致性(Uniformity)和穩(wěn)定性(Stability)的栽培鑒定試驗或室內(nèi)分析測試,并根據(jù)試驗或測試結(jié)果判定該植物品種是否屬于新品種，為植物新品種保護(hù)提供可靠的判定依據(jù)。目前，DUS測試方法仍然采用田間種植鑒定 ，是將申請品種與近似品種在相同的生長條件下，從植物的種子、幼苗、開花期、成熟期等各個階段對多個質(zhì)量性狀、數(shù)量性狀及抗病性等作出觀察記載，并與近似品種進(jìn)行結(jié)果比較，一般要經(jīng)過2 3年的重復(fù)觀察，才能最后作出合理、客觀的評價。自相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)頒布以來，在植物新品種DUS測試中起著重要作用。但因存在鑒定周期長、易受環(huán)境影響、測試性狀多、工作量大等問題，無法適應(yīng)大量品種的測試需求。分子標(biāo)記是以個體間核苷酸序列變異為基礎(chǔ)的遺傳標(biāo)記，是DNA水平遺傳多態(tài)性的直接反映。分子標(biāo)記檢測技術(shù)具有測試周期短、不受環(huán)境影響和季節(jié)限制、沒有組織特異性、供選擇的標(biāo)記數(shù)量多、可以進(jìn)行高通量測試分析等優(yōu)勢，已逐步用于新品種鑒定、種子純度及品種真實性檢測中。王志民用小麥和珍珠粟的RFLP探針，可以有效區(qū)分谷子品種。楊天育利用RAH)標(biāo)記，可以將不同生態(tài)類型的谷子品種區(qū)別開。但是，RAH)重復(fù)性較差；AFLP操作較復(fù)雜，穩(wěn)定性較差；RFLP操作過程繁瑣，效率低，成本高。SSR(Simple SequenceRepeats)，是以I飛個核苷酸為單位、呈串聯(lián)重復(fù)的DNA序列，廣泛分布于真核生物基因組中。與其他分子標(biāo)記相比，SSR標(biāo)記具有共顯性、多態(tài)性高、重復(fù)性好、操作簡單等優(yōu)點，已經(jīng)作為重要的DNA標(biāo)記廣泛應(yīng)用于植物遺傳多樣性研究、品種鑒定、遺傳圖譜的構(gòu)建、QTL定位、標(biāo)記輔助選擇及比較基因組研究等領(lǐng)域。與水稻、小麥等作物相比，現(xiàn)有的谷子SSR標(biāo)記數(shù)量少，不能滿足谷子研究的需要，大量開發(fā)覆蓋全基因組的SSR標(biāo)記仍是目前谷子研究的重要工作之一。
技術(shù)實現(xiàn)思路
本專利技術(shù)的目的在于提供一套基于谷子全基因組序列開發(fā)的SSR核心引物組，這些引物具有擴(kuò)增穩(wěn)定、電泳條帶清晰、多態(tài)性豐富的優(yōu)點，可有效用于谷子遺傳多樣性、品種鑒定、DNA指紋圖譜構(gòu)建等研究。本專利技術(shù)的另一目的在于提供了 SSR核心引物組在谷子遺傳多樣性和品種鑒定中的應(yīng)用，該方法可靠、迅速，能準(zhǔn)確區(qū)分谷子品種間差異并最大限度準(zhǔn)確反映谷子品種間的親緣關(guān)系。本專利技術(shù)的技術(shù)方案是基于谷子全基因組序列開發(fā)的SSR核心引物組，其特征是，它包括30對引物，其核苷酸序列如序列表SEQ ID No.1 60所示。上述的SSR核心引物組在谷子遺傳多樣性分析和品種鑒定方面的應(yīng)用。上述的SSR核心引物組進(jìn)行谷子遺傳多樣性分析的方法，其特征是，(I) DNA 提取利用改良的CTAB法提取待鑒定樣品總DNA ；(2 )引物擴(kuò)增及電泳檢測以步驟(I)提取的待鑒定樣品為I旲板，利用如序列表SEQ ID No.1 60所不的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增；擴(kuò)增產(chǎn)物采用6%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，銀染顯色。PCR 體系(12. 5 μ L)包括1. 25 μ LlOXTaq Buffer,1. 5mmol/L Mg2+，O. 25mmol/LdNTP，上下游引物各0. 4m mol/L,0. 5UTaq酶和2(T50ngDNA模板。PCR程序為94°C預(yù)變性4min ；94°C 45s, (Tm) V 45s, 72 °C 45s，共 35 個循環(huán)；72°C 延伸 IOmin ;4°C 保存。PCR 產(chǎn)物加入6ul6 X loading buffer, 95 °C變性5min,冰浴5min,采用6%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測。電泳在Sequ1-Gen GT核酸電泳系統(tǒng)(Bio-Rad，USA)中進(jìn)行。取3ul樣品，以pBR322DNA/MspI為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)，60W恒功率電泳1. 5h，銀染顯色。(3)根據(jù)DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)和引物的遷移率記錄結(jié)果，遷移率最大(分子量最小)的條帶記為1，遷移率次之的記為2，依次類推，無條帶記為0，建立供試材料SSR基因型信息數(shù)據(jù)庫，進(jìn)行谷子品種鑒定或遺傳多樣性分析。所述谷子品種鑒定方法為統(tǒng)計每個品種在引物中的擴(kuò)增情況，構(gòu)建DNA指紋圖譜，一一比較各引物位點差異。差異引物數(shù)3 2，判定兩個品種為不同品種；差異引物數(shù)=1，判定兩個品種為近似品種；差異引物數(shù)=0，判定兩個品種為相同品種。所述遺傳多樣性分析為利用PowerMarker V3. 25計算引物的等位基因數(shù)(Na)、基因多樣性指數(shù)(He)、多態(tài)性信息量(PIC)。利用NTSYS-pc V2.1Oe軟件計算品種間的遺傳相似系數(shù)，用UPGMA法進(jìn)行聚類分析，繪制樹狀圖。本專利技術(shù)的有益效果本專利技術(shù)的30對SSR核心引物(即SSR標(biāo)記)在谷子基因組中分布均勻、多態(tài)性豐富、擴(kuò)增穩(wěn)定、擴(kuò)增條帶易于鑒定，可用于谷子品種指紋圖譜數(shù)據(jù)庫構(gòu)建、品種鑒定、品種權(quán)保護(hù)、品種審定、種質(zhì)資源管理和遺傳多樣性評價等領(lǐng)域，有利于保護(hù)育種者、生產(chǎn)者和消費者的合法權(quán)益，促進(jìn)谷子遺傳育種水平的提高和谷子產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。附圖說明圖1為SSRHunterl. 3軟件搜索結(jié)果示意圖；圖2為引物S226在41份谷子品種中檢測到的多態(tài)性；圖3為聚類分析結(jié)果圖。具體實施例方式實施例1 :谷子基因組SSR標(biāo)記在品種鑒定中的應(yīng)用1.谷子基因組DNA的提取( 1)材料從谷子核心種質(zhì)材料中選取41份有代表性的地方品種和育成品種，共涉及東北平原、華北平原、淮河以南、黃土高原、內(nèi)蒙高原及西北內(nèi)陸6個生態(tài)區(qū)(見表1)，用于谷子引物的評價和品種鑒定研究。表1本專利技術(shù)中用于谷子品種鑒定的材料信息 品種編號國家?guī)炀幪柶贩N名稱省份/地區(qū)生態(tài)區(qū)品種類型本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護(hù)點】
基于谷子全基因組序列開發(fā)的SSR核心引物組，其特征是，它包括30對引物，其核苷酸序列如序列表SEQ?ID?No.1～60所示。
【技術(shù)特征摘要】
1.基于谷子全基因組序列開發(fā)的SSR核心引物組，其特征是，它包括30對引物，其核苷酸序列如序列表SEQ ID No.1 60所示。2.權(quán)利要求1所述的SSR核心引物組在谷子品種鑒定方面的應(yīng)用。3.利用權(quán)利要求1所述的SSR核心引物組進(jìn)行谷子品種鑒定的方法，其特征是， (1)DNA提取 利用改良的CTAB法提取待鑒定樣品總DNA ； (2)引物擴(kuò)增及電泳檢測 以步驟(I)提取的待鑒定樣品為模板，利用如序列表SEQ ID No.1 60所示的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增；擴(kuò)增產(chǎn)物采用6%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，銀染顯色； (3)根據(jù)DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)和引物的遷移率記錄結(jié)果，遷移率最大的條帶記為1，遷移率次之的記為2，依次類推，無條帶記為0，建立供試材料SSR基因型信息數(shù)據(jù)庫，進(jìn)行谷子品種鑒定；所述谷子品種鑒定方法為統(tǒng)計每個品種在引物中的擴(kuò)增情況，構(gòu)建DNA指紋圖譜，一一比較各引物位點差異，差異引物數(shù)3 2，判定兩個品種為不同品種；差異引物數(shù)=1，判定兩個品種為近似品種；差異引物數(shù)=0，判定兩個品種為相同品種。4.如權(quán)利要求3所述的進(jìn)行谷子品種鑒定的方法，其特征是，所述步驟(2)12.5yL的 PCR 體系包括 L 25 μ LlOXTaq Buffer,1. 5mmol/L Mg2+, O. 25mmol/L dNTP，上下游引物各 O. 4mmol/L,0. 5UTaq 酶和 20 50ngDNA 模板；PCR 程序為94 °C 預(yù)變性 4min ；94°C 45s,(Tm) V 45s, 72°C 45s，共 35 個循環(huán)；72°C延伸 IOmin ;4°C保存。5.權(quán)利要求1所述的SSR核心引物組品種在谷子遺傳多樣性分析方面的應(yīng)用。6.利用權(quán)利要求1所述的SSR核心引物組進(jìn)行谷子遺傳多樣性分析的方法，其特征是， (1)DNA提取 利用改良的CTAB法提取待鑒定樣品總DNA ； (2)引物擴(kuò)增及電泳檢測 以步驟(I)提取的待鑒定樣品為模板，利用如序列表SEQ ID No.1 60所示的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增；擴(kuò)增產(chǎn)物采用6%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，銀染顯色； (3)根據(jù)DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)和引物的遷移率記錄結(jié)果，遷移率最大的條帶記為1，遷移率次之的...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：李汝玉，張晗，王雪梅，王東建，姚鳳霞，許金芳，孫加梅，鄭永勝，段麗麗，李華，
申請(專利權(quán))人：山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所，
類型：發(fā)明
國別省市：
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