用于在植物中生產蛋白質的方法技術

本發明專利技術涉及用于在植物中瞬時表達目的蛋白質，特別是有藥物價值的蛋白質的方法。特別地，本發明專利技術提供了用于將土壤桿菌屬細胞引入全部植物或植物器官內的改良方法。本發明專利技術的方法提供了許多植物個別或同時的有效土壤桿菌滲入，導致高于通過其他方法獲得的重組蛋白質得率。該方法可以容易地依比例決定且自動化，以滿足重組蛋白質的變化的需求。

【技術實現步驟摘要】
【國外來華專利技術】用于在植物中生產蛋白質的方法本專利技術涉及用于在植物中瞬時表達目的蛋白質特別是有藥物價值的蛋白質的方法。重組蛋白質的大規模生產是轉基因植物的重要應用。盡管許多植物能夠成功地用于重組蛋白質生產，但少數系統具有在短時間段內生產大量重組蛋白質的潛力。在植物細胞中的瞬時基因表達已作為快速工具開發，以產生少量給定蛋白質且用于測試遺傳構建體。在植物細胞中瞬時生產蛋白質的方法包括例如以可表達方式的包含編碼所需蛋白質的基因的核酸分子的粒子槍遞送、土壤桿菌屬（Agrobacterium）介導的包含可表達基因的二元載體遞送、原生質體的電穿孔、和聚乙二醇介導的裸露DNA遞送到植物原生質體內。粒子轟擊通常僅到達少數細胞，并且DNA必須到達細胞核用于轉錄完成，因此對于瞬時表達不是非常有效。通過滲入遞送的土壤桿菌屬（土壤桿菌滲入（agro-infiltration））的使用可以將外源基因遞送給明顯更高數目的細胞。用于瞬時表達的土壤桿菌屬滲入的原始系統通過Kapila等人，PlantSci.122：101-108（1997）描述，并且開發用于快速測試被認為對于植物組織的疾病抗性有用的蛋白質的功能性。對于這個應用，蛋白質無需是純化的或表征的，因為整個植物組織可以用于生物測定中。這個系統以后用于表達藥學上重要的蛋白質（Vaquero等人，Mol.Biotechnol.5：209-21（1996））。然而，來自這個系統的生產是相對低的。WO99/48355公開了植物的遺傳轉化方法，其包括步驟：（a）將植物組織浸入包括感染性轉化載體例如土壤桿菌屬的介質中；（b）將對所述組織的壓力減少至-10至-100kPa規格；（c）將所述壓力維持10–60分鐘，和（d）將所述壓力升高至大氣壓或以上，其中允許選擇轉化載體，以鑒定其中轉化載體整合到所述植物組織或細胞的基因組內的植物細胞或組織。進一步公開的是可以對植物材料實施減壓和超壓的交替循環，其中所述壓力在10-500kPa（0.1-5巴）的范圍中。EP1662002公開了土壤桿菌屬介導的基因轉導和轉化的方法，其包括制備植物材料，用攜帶含有所需轉基因的載體的土壤桿菌屬感染植物材料。該方法的進一步部分是在制備植物材料的過程中，或在制備后但在用土壤桿菌屬感染前，使植物材料加壓。WO01/12828描述了包含真空室、用于生成真空的工具、和在真空生成工具和真空室之間的連接器、和進一步的用于附著或支持真空室內的植物的工具的儀器。存在關于可以在短時間段內以商業規模生產大量重組蛋白質的系統和方法的需要，所述重組蛋白質例如用于預防大范圍流行暴發或新出現的疾病的亞單位疫苗。本專利技術提供了滿足這個需要的工具和方法。特別地，在一個實施方案中，本專利技術提供了用于生產目的異源肽或蛋白質的方法，其包括：（i）使全部植物、特別是全部和完整植物或全部和完整植物的部分、或者多個全部和完整植物或全部和完整植物的多個部分與懸浮于流體中的土壤桿菌屬細胞接觸，其中所述土壤桿菌屬細胞包含編碼目的異源肽或蛋白質的可表達、特別是植物可表達構建體；（ii）用一個或多個壓力循環處理所述植物或植物部分、或多個植物或植物部分和土壤桿菌屬細胞，由此所述土壤桿菌屬細胞滲入全部植物或植物部分內，和其中可表達構建體選擇為提供目的異源肽或蛋白質的瞬時表達，并且壓力循環中的至少一個包含壓力相對于大氣壓的增加。在本專利技術的特定實施方案中，將植物用一個或多個壓力循環處理，其中全部包含壓力相對于大氣壓的增加。在特定實施方案中，壓力/循環維持0.5秒–60秒的時期。在一個實施方案中，本專利技術提供了用于將土壤桿菌屬滲入植物或植物部分、或者多個植物或植物部分內的方法，其包括：（i）使全部植物、特別是全部和完整植物或全部和完整植物的部分、或者多個全部和完整植物或全部和完整植物的多個部分與懸浮于流體中的土壤桿菌屬細胞接觸；（ii）用一個或多個壓力循環處理所述植物或植物部分、或多個植物或植物部分和土壤桿菌屬細胞，其中可表達構建體選擇為提供目的異源肽或蛋白質的瞬時表達，并且壓力循環中的至少一個包含壓力相對于大氣壓的增加。在本專利技術的特定實施方案中，將植物用一個或多個壓力循環處理，其中全部包含壓力相對于大氣壓的增加。在特定實施方案中，壓力/循環維持0.5秒–60秒的時期。在本專利技術的一個實施方案中，將全部植物、特別是全部和完整植物或全部和完整植物的部分、或者多個全部和完整植物或全部和完整植物的多個部分和土壤桿菌屬細胞在封閉系統內用一個或多個壓力循環處理，所述封閉系統特別是包含配置為接受全部植物、特別是全部和完整植物或全部和完整植物的部分的室，和用于可調節地增加室中的氣壓和/或液壓的工具的系統。在本專利技術的一個實施方案中，室這樣配置，從而使得整個植物體包括其地上和地下部分都浸沒到含有土壤桿菌屬細胞的滲入介質內，并且實施在一個或多個壓力循環過程中施加的壓力。在本專利技術的另一個實施方案中，室這樣配置，從而使得僅植物的地上部分的全部或部分浸沒到含有土壤桿菌屬細胞的滲入介質內，但對整個植物包括植物的地上部分以及地下部分實施在一個或多個壓力循環過程中施加的壓力。在本專利技術的另外一個實施方案中，室這樣配置，從而使得植物的地上部分的全部或部分浸沒到含有土壤桿菌屬細胞的滲入介質內，并且暴露于在一個或多個壓力循環中的壓力，而植物的地下部分特別是植物根置于室的外部，從而使得它們不浸沒到包含土壤桿菌屬細胞的滲入介質中，并且不實施在一個或多個壓力循環過程中施加的壓力。在本專利技術的一個實施方案中，在所述植物或植物部分與細菌細胞懸液中的土壤桿菌屬細胞接觸的同時，對全部和完整植物或全部和完整植物的部分施加包含一個或多個壓力循環的壓力處理。在本專利技術的一個實施方案中，土壤桿菌屬細胞的懸液包含至少1.0、特別是至少1.5、特別是至少2.0、特別是至少2.5、特別是至少3.0、特別是至少3.5、特別是至少4.0、特別是至少4.5的OD600。在本專利技術的一個實施方案中，壓力循環中的至少一個包含對全部植物、特別是全部和完整植物或全部和完整植物的部分、或者多個全部和完整植物或全部和完整植物的多個部分實施相對于大氣壓增加的壓力，特別是對全部和完整植物或全部和完整植物的部分實施下述壓力：至少0.5巴、特別是至少1.0巴、特別是至少1.5巴、特別是至少2.0巴、特別是至少2.5巴、特別是至少3.0巴、特別是至少3.5巴、特別是至少4.0巴、特別是至少4.5巴、特別是至少5.0巴、特別是至少5.5巴、特別是至少6.0巴、特別是至少7.0巴、特別是至少8.0巴、特別是至少9.0巴、特別是至少10.0巴、特別是至少11.0巴且特別是至少12.0巴。允許細菌懸液最大限度滲入植物或植物部分內而不損害植物的最佳壓力可以取決于在滲入方法中使用的植物物種而改變，并且在給定植物物種內，還取決于變種。最佳壓力條件可以通過使用如本文在實施例中公開的測試系統通過本領域技術人員容易地測定。在本專利技術的一個實施方案中，處理全部植物、特別是全部和完整植物或全部和完整植物的部分、或者多個全部和完整植物或全部和完整植物的多個部分的步驟包括至少2個循環、特別是至少3個循環、特別是至少4個循環、特別是至少5個循環、特別是至少6個循環、特別是至少7個循環、特別是至少8個循環、特別是至少9個循本文檔來自技高網...

【技術保護點】

【技術特征摘要】
【國外來華專利技術】2010.07.16 EP 10169888.41.一種用于生產目的異源肽或蛋白質的方法，其包括：a)使全部和完整植物或全部和完整植物的部分與懸浮于流體中的土壤桿菌屬細胞接觸，其中所述土壤桿菌屬細胞包含編碼目的異源肽或蛋白質的可表達構建體；b)在系統內用兩個或更多個正壓循環處理所述全部和完整植物或全部和完整植物的部分和所述土壤桿菌屬細胞，所述系統包含配置為接受全部植物或植物部分的室，和用于可調節地增加室中的氣壓和/或液壓的工具，由此所述土壤桿菌屬細胞滲入所述全部植物或植物部分內，其中每循環維持至少2.0巴的壓力0.5秒–60秒的時期。2.一種用于將土壤桿菌屬細胞滲入全部和完整植物或全部和完整植物的部分內的方法，其包括：a)使全部和完整植物或全部和完整植物的部分與懸浮于流體中的土壤桿菌屬細胞接觸；b)在系統內用兩個或更多個正壓循環處理所述全部植物或全部和完整植物的部分和所述土壤桿菌屬細胞，所述系統包含配置為接受全部植物或植物部分的室，和用于可調節地增加室中的氣壓和/或液壓的工具，其中每循環維持至少2.0巴的壓力0.5秒–60秒的時期。3.權利要求1的方法，其中所述可表達構建體是植物可表達構建體，并且選擇為提供所述目的異源肽或蛋白質的瞬時表達。4.權利要求1－3中任一項的方法，其中所述土壤桿菌屬細胞的懸液的OD600至少為1.0。5.權利要求1－3中任一項的方法，其中所述室這樣配置，從而使得整個植物體包括其地上和地下部分都浸沒到含有土壤桿菌屬細胞的滲入介質內，并且實施在兩個或更多個壓力循環過程中施加的壓力。6.權利要求1－3中任一項的方法，其中所述室這樣配置，從而使得僅所述植物的地上部分的全部或部分浸沒到含有土壤桿菌屬細胞的滲入介質內，但對整個植物包括植物的地上部分以及地下部分實施在兩個或更多個壓力循環過程中施加的壓力。7.權利要求1－3中任一項的方法，其中所述室這樣配置，從而使得所述植物的地上部分的全部或部分浸沒到含有土壤桿菌屬細胞的滲入介質內，并且暴露于在兩個或更多個壓力循環中的壓力，而所述植物的地下部分置于室的外部，從而使得它們不浸沒到包含土壤桿菌屬細胞的滲入介質中，并且不實施在兩個或更多個壓力循環過程中施加的壓力。8.權利要求7的方法，其中所述植物的地下部分是植物根。9.權利要求1－3中任一項的方法，其中所述處理所述全部植物或植物部分的步驟包括a)至少3個循環。10.權利要求1－3中任一項的方法，其中所述處理所述全部植物或植物部分的步驟包括b)至少4個循環。11.權利要求1－3中任一項的方法，其中所述處理所述全部植物或植物部分的步驟包括c)至少8個循環。12.權利要求1－3中任一項的方法，其中所述壓力循環中的至少一個包含用下述壓力處理所述全部植物或植物部分a)至少3.5巴...

【專利技術屬性】
技術研發人員：A·卡拉羅，J·法烏克內爾，Y·克里普費爾，O·米洛諾夫，K·奧伊施，S·羅伊施蒂，
申請(專利權)人：菲利普莫里斯生產公司，
類型：
國別省市：