本發明專利技術提供一種殼聚糖包裹負電荷金納米粒及其制備方法和應用，首先將殼聚糖或葉酸修飾的殼聚糖通過三聚磷酸鈉交聯后經超聲分散制得凝膠納米粒，其次，將負電荷金納米粒加入凝膠納米粒溶液中，攪拌混合15分鐘-2小時。本發明專利技術采用殼聚糖包裹負電荷的金納米粒解決了負電荷金納米粒入胞效率不足的缺點，葉酸殼聚糖可通過葉酸的主動靶向作用進一步提高金納米粒的入胞率，在進入細胞后，負電荷金納米粒則能發揮其載藥率高的優勢，顯著增高藥物裝載率，及其優于正電荷金納米粒的優勢，顯著降低細胞毒性，本發明專利技術采用殼聚糖凝膠納米粒包裹負電荷金納米粒，與單純使用殼聚糖及其衍生物作為藥物載體相比，藥物的載藥率及入胞率得到顯著提高。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于制藥
，具體涉及一種殼聚糖包裹負電荷金納米粒及其制備方法和應用。
技術介紹
膠體金納米粒在生命科學研究領域應用廣泛，如藥物轉運，基因轉染，生物探針及組織分析等領域。尤其在化療藥物運載領域，納米金由于其粒徑小，比表面積大等優勢，可極大的提升化療藥的載藥量。哺乳動物細胞膜表面絕大部分區域帶有負電荷，僅有少部分區域為中性或帶有正電荷。由于靜電斥力，陰離子分子難于與細胞表面結合，一般通過胞吞機制入胞。最近的研究結果表明，正電荷的金納米粒與細胞膜的結合能力為負電荷金納米粒的3倍以上，入胞能力是負電荷金納米粒的5倍以上。然而,Goodman小組的研究表明，正電荷的金納米粒具有細胞毒性，而負電荷的金納米粒生物相容性良好，無細胞毒性。Hauck小組的研究也表明，正電荷金納米粒的細胞毒性為負電荷金納米粒的27倍以上。上述缺點是金納米粒作為藥物載體的瓶頸。
技術實現思路
本專利技術的目的在于提供一種殼聚糖包裹負電荷金納米粒及其制備方法和應用，可有效提高藥物的入胞率和載體的載藥率。為達到上述目的，本專利技術采用了以下技術方案。一種殼聚糖包裹負電荷金納米粒，包括殼聚糖(CS )凝膠納米粒以及包裹于殼聚糖凝膠納米粒內的用于載藥的負電荷金納米粒。所述殼聚糖凝膠納米粒上連接有用于與細胞表面受體結合的配體。所述配體為葉酸(FA);通過在殼聚糖凝膠納米粒上連接配體如葉酸分子，可以提高殼聚糖包裹負電荷金納米粒的入胞效率。所述負電荷金納米粒為C5-Au-C1 fCOOH。上述殼聚糖包裹負電荷金納米粒的制備方法，包括以下步驟:首先，將殼聚糖通過三聚磷酸鈉交聯制得納米凝膠，將納米凝膠經超聲分散制得凝膠納米粒溶液，其次，將負電荷金納米粒加入凝膠納米粒溶液中，攪拌混合15分鐘-2小時。所述納米凝膠的制備方法為:將殼聚糖溶解于體積分數為0.5-5%的醋酸水溶液中得質量濃度為1.5mg/mL的殼聚糖溶液A，將殼聚糖溶液A的pH調節為4.0-6.0后得殼聚糖溶液B，向殼聚糖溶液B中加入質量濃度為0.6mg/mL的三聚磷酸鈉(TPP)水溶液，然后攪拌10-60分鐘得殼聚糖納米凝膠， 殼聚糖溶液B與三聚磷酸鈉水溶液的體積比為1:0.1-1.5。所述殼聚糖在交聯前用葉酸進行修飾。所述納米凝膠采用以下方法制備:將殼聚糖溶解于體積分數為0.5-5%的醋酸水溶液中得質量濃度為1.5mg/mL的殼聚糖溶液A，將1_ (3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)、琥珀酰亞胺(NHS)與葉酸(FA)加入二甲基亞砜(DMSO)中，攪拌0.5-2小時得混合溶液，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽:琥珀酰亞胺:葉酸的摩爾比為(1.2-2): (1.0-1.5):1，將殼聚糖溶液A的pH調節為4.0-6.0后得殼聚糖溶液B，按照殼聚糖與葉酸的摩爾比為1:1向殼聚糖溶液B中加入混合溶液，然后避光攪拌12-48小時，攪拌后用NaOH水溶液調節pH值至8.0-10.0得反應液，向反應液中加入質量濃度為0.6mg/mL的三聚磷酸鈉水溶液，殼聚糖溶液B與三聚磷酸鈉水溶液的體積比為1:0.1-1.5，然后攪拌10-60分鐘，攪拌后在pH為7.4的磷酸緩沖液(PBS)中透析3天得葉酸修飾的殼聚糖(FA-CS)納米凝膠。本專利技術通過調節pH、殼聚糖與三聚磷酸鈉的比例，可以降低殼聚糖凝膠的沉淀，獲得更多的凝膠納米粒。用0.6mg/ml的TPP溶液進行交聯，使得到的納米凝膠粒度更均勻，且分散性更好，粒徑更小，更適合作為納米藥物載體。所述負電荷金納米粒(C5-Au-Cll-COOH)的制備方法為:在氮氣保護條件下將納米金核(Au-C5)和11-巰基i^一烷酸(MUA)在二氯甲烷(DCM)中攪拌反應24-36小時，納米金核與11-巰基十一烷酸的摩爾比為1:3_6，攪拌反應后旋轉蒸發除去二氯甲烷、收集沉淀(C5-Au-C11-COOH),分別用正己烷、二氯甲烷洗滌沉淀，洗滌后旋轉蒸發去除正己烷以及二氯甲烷，然后用蒸餾水溶解，溶解后在去離子水中透析2-7天，透析后冷凍干燥得負電荷金納米粒。上述殼聚糖包裹負電荷金納米粒在向細胞內轉運藥物中的應用。 所述殼聚糖包裹負電荷金納米粒的入胞效率大于50%，而葉酸修飾的殼聚糖包裹負電荷金納米粒的入胞效率大于95%。本專利技術的有益效果體現在:本專利技術采用正電荷的生物材料殼聚糖包裹負電荷的金納米粒解決了負電荷金納米粒入胞效率不足的缺點，在進入細胞后，負電荷金納米粒則能發揮其優于正電荷金納米粒的優勢，在提高載藥率的同時顯著降低細胞毒性。本專利技術選用殼聚糖作為金納米粒的轉運載體，能促進負電荷金納米粒的入胞，通過將葉酸接合至殼聚糖凝膠納米粒的表面，可以發揮葉酸的主動靶向作用，可將負電荷金納米粒的入胞效率從50%提升至95%以上，FA-CS包裹負電荷金納米粒載體有望成為抗腫瘤藥物轉運更為有效的新體系。本專利技術采用殼聚糖凝膠納米粒包裹負電荷金納米粒，與單純使用殼聚糖作為藥物載體相比，藥物的載藥率得到顯著提高。附圖說明圖1為負電荷金納米粒(C5-Au-C11-COOH)的1H-NMR譜圖；圖2為粒度分布圖；圖2a為CS凝膠納米粒粒度分布圖；圖2b為FA-CS凝膠納米粒粒度分布圖；圖2c為FA-CS凝膠納米粒包裹負電荷金納米粒(C5-Au-C11-COOH)粒度分布圖；圖3為FA-CS凝膠納米粒包裹負電荷金納米粒在不同溶劑中的粒度分布圖；圖3a溶劑為含10%牛血清的DMEM培養液；圖3b溶劑為PBS緩沖液；圖4為為FA-CS凝膠納米粒包裹負電荷金納米粒在不同溶劑中的Zeta電位分布圖；圖4a溶劑為PBS緩沖液；圖4b溶劑為含10%牛血清的DMEM培養液；圖5為CS凝膠納米粒包裹C5-Au-C11-COOH的TEM圖；圖6為FA-CS凝膠納米粒包裹C5-Au-C11-COOH的TEM圖；圖7為Western blot檢測三種細胞中FR- α受體表達凝膠電泳圖；圖8為不同濃度負電荷金納米粒(C5-Au-C11-COOH)的細胞成活率曲線；橫坐標為金納米粒濃度負對數，縱坐標為細胞成活率(％)；圖9為ICP-MS檢測細胞內負電荷金納米粒含量柱狀圖；圖9a為Hela細胞ICP-MS的分析結果；圖9b為Hela folate free細胞ICP-MS的分析結果；圖9c為A549細胞ICP-MS的分析結果；AU表示C5-Au-C11-COOH金納米粒，AUFACS表示FA-CS凝膠納米粒包裹C5-Au-C11-COOH, AUCS 表示 CS 凝膠納米粒包裹 C5-Au-C11-COOH。具體實施例方式下面結合附圖對專利技術作進一步說明。I 材料負電荷金納米粒(C5-Au-C11-COOH)為實驗室自制，其余化學試劑均購于Sigma-Aldrich或Fischer ·Scientific試劑公司。其中二氯甲燒(DCM)干燥除水后使用。核磁共振儀為BRUKER Avance 400MHz，透射電鏡為JEOL 7C，使用條件:80kev。粒度分析儀器為 Malvern Zetasizer Nano ZS02 方法2.1制備負電荷金納米粒(C5-Au-C11-COOH)I)以甲苯-水為兩相反應溶齊LI,合成2nm納米金核(Au-C5X Ig四氯金酸溶解于250mL水中得四氯金本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種殼聚糖包裹負電荷金納米粒，其特征在于：包括殼聚糖凝膠納米粒以及包裹于殼聚糖凝膠納米粒內的用于載藥的負電荷金納米粒。
【技術特征摘要】
1.一種殼聚糖包裹負電荷金納米粒，其特征在于:包括殼聚糖凝膠納米粒以及包裹于殼聚糖凝膠納米粒內的用于載藥的負電荷金納米粒。2.根據權利要求1所述一種殼聚糖包裹負電荷金納米粒，其特征在于:所述殼聚糖凝膠納米粒上連接有用于與細胞表面受體結合的配體。3.根據權利要求2所述一種殼聚糖包裹負電荷金納米粒，其特征在于:所述配體為葉酸。4.根據權利要求1所述一種殼聚糖包裹負電荷金納米粒，其特征在于:所述負電荷金納米粒為 C5-Au-C11-COOH05.一種制備如權利要求1所述殼聚糖包裹負電荷金納米粒的方法，其特征在于:包括以下步驟:首先，將殼聚糖通過三聚磷酸鈉交聯制得納米凝膠，將納米凝膠經超聲分散制得凝膠納米粒溶液，其次，將負電荷金納米粒加入凝膠納米粒溶液中，然后攪拌混合15分鐘-2小時。6.根據權利要求5所述一種制備殼聚糖包裹負電荷金納米粒的方法，其特征在于:所述納米凝膠的制備方法為:將殼聚糖溶解于體積分數為0.5-5%的醋酸水溶液中得質量濃度為1.5mg/mL的殼聚糖溶液A，將殼聚糖溶液A的pH調節為4.0-6.0后得殼聚糖溶液B，向殼聚糖溶液B中加入質量濃度為0.6mg/mL的三聚磷酸鈉水溶液，然后攪拌10-60分鐘，殼聚糖溶液B與三聚磷酸鈉水溶液的體積比為1:0.1-1.5。7.根據權利要求5所述一種制備殼聚糖包裹負電荷金納米粒的方法，其特征在于:所述殼聚糖在交聯前用葉酸進行修飾。8.根據權利要求7所述一種制備殼聚糖包裹負電荷金納米粒的方法，其特征在于:...
【專利技術屬性】
技術研發人員：范黎，吳紅，喬友備，
申請(專利權)人：中國人民解放軍第四軍醫大學，
類型：發明
國別省市：
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