細胞培養用溫度應答性基材及其制造方法技術

本發明專利技術的目的是簡便地制作細胞培養用溫度應答性表面，所述表面可效率良好地培養細胞，而且僅通過改變基材面的溫度即可效率良好地剝離培養細胞或細胞片。本發明專利技術的細胞培養用溫度應答性基材，在基材表面被覆有嵌段共聚物，所述嵌段共聚物具有水不溶性聚合物鏈段與溫度應答性聚合物鏈段結合的結構，在基材表面作為溫度應答性聚合物以0.8～3.0μg/cm2的比例進行被覆。

【技術實現步驟摘要】
【國外來華專利技術】
本專利技術涉及在生物學、醫學等領域中有用的細胞培養基材。本申請是主張以2010年8月31日提出的日本專利申請(特愿2010-208506號)為基礎的優先權的申請。
技術介紹
現在，動物細胞培養技術顯著進步，將動物細胞作為對象的研究開發也在各種各樣的領域中廣泛實施。成為對象的動物細胞的使用方法，也不僅僅是將開發當初的細胞本身進行制品化，或者將其產生物進行制品化，現在通過分析細胞或其表層蛋白質來設計有用的藥品，在體外增殖患者本人的細胞，或者提高該細胞的功能后，返回患者的體內進行治療的方法也正在實施。現在，培養動物細胞的技術，受到很多研究者的關注。但是，包含人細胞的動物細胞很多有附著依存性。即，要在體外培養動物細胞時，必須將它們一次附著于成為立腳點的任何基材上。基于這樣的背景，比以前多的研究者們進行了對于細胞更優選的基材表面的設計及規劃。但是，這些技術都僅僅是與細胞培養時有關系的技術。附著依存性的培養細胞附著于某種基材時，自身產生粘著性蛋白質。因此剝離該細胞時，通過以往技術，例如，通過酶處理等必須破壞其粘著性蛋白質。其結果，存在著細胞在培養中產生的各種細胞固有的細胞表層蛋白也同時被破壞這樣的缺點，盡管這樣，現實的情況是完全沒有解決的方法，特別是沒有進行研究。基于這樣的背景，在特開平2-211865號公報(專利文獻I)中公開了一種新的細胞培養方法，即在以對于水的上限或下限臨界溶解溫度為0 80°C的高分子被覆基材表面的細胞培養支持體上，在上限臨界溶解溫度以下或下限臨界溶解溫度以上培養細胞，其后通過使其溫度達到上限臨界溶解溫度以上或下限臨界溶解溫度以下，沒有酶處理而使培養細胞剝離。另外，在特開平05 -192138號公報(專利文獻2)中公開了，利用特開平2-211865號公報(專利文獻I)中公開的的溫度應答性細胞培養基材并在上限臨界溶解溫度以下或者下限臨界溶解溫度以上來培養皮膚細胞，其后通過使其溫度達到上限臨界溶解溫度以上或者下限臨界溶解溫度以下，以低損傷使得培養皮膚細胞剝離。進而，在特愿2007-105311號公報(專利文獻3)中公開了一種培養細胞的表層蛋白質修復方法，該方法使用了特開平2-211865號公報(專利文獻I)中公開的溫度應答性細胞培養基材。通過利用這樣的溫度應答性細胞培養基材，相對于以往的培養技術正謀求各種各樣新的發展。但是，以往技術，將化學上惰性的工程塑料的表面使用如電子射線等的高能量進行被覆加工，因此如電子射線照射裝置那樣龐大的裝置是必要的，因此，存在基材的價格也必然變高這樣的問題。為了解決這樣的問題，目前為止已開發了幾個技術。已知例如，Soft Matter, 5,2937-2946 (2009)(非專利文獻 l)、Interface, 4，1151-1157 (2007)(非專利文獻 2)中所記載的那樣，合成具有特定的分子結構的聚合物，向基材表面進行被覆的方法。但是，任一種技術，都沒有能夠達到可與以往的細胞培養用基材同等地培養細胞，與使用上述電子射線制作的細胞培養用溫度應答性基材同等地僅使細胞進行溫度變化來使其剝離，或在培養細胞成為融合的狀態時作為細胞片使其剝離的技術水平。現有技術文獻專利文獻專利文獻1:特開平2-211865號公報專利文獻2:特開平05-192138號公報專利文獻3:特愿2007-105311號公報非專利文獻非專利文獻I:Soft Matter, 5，2937-2946 (2009)非專利文獻2:1nterface，4，1151-1157 (2007)
技術實現思路
專利技術要解決的課題本專利技術是為了解決如上述以往技術的問題而完成。即，本專利技術的目的在于，提供根據與以往技術完全不同的想法制作的新的。解決課題的方法 本專利技術者為了解決上述課題，從各種角度進行研討，進行研究開發。其結果，令人驚奇地是本專利技術者發現，將具有水不溶性聚合物鏈段與溫度應答性聚合物鏈段結合的結構的嵌段共聚物在基材表面作為溫度應答性聚合物成分以0.8 3.0y g/cm2的比例進行被覆，可效率良好地培養細胞，而且僅改變基材面的溫度即可效率良好地剝離培養細胞或細胞片。這些認識，是本專利技術者著眼于具有水不溶性聚合物鏈段與溫度應答性聚合物鏈段結合的結構的嵌段共聚物所具有的立體規則性、以及基材表面上的形態，并基于深入研究的結果。進而，可知這樣的細胞培養用基材與以往技術的溫度應答性細胞培養用基材相比具有高性能。本專利技術是根據該認識而完成。通過本專利技術，提供一種細胞培養用溫度應答性基材，在基材表面被覆有嵌段共聚物，所述嵌段共聚物具有水不溶性聚合物鏈段與溫度應答性聚合物鏈段結合的結構，在基材表面作為溫度應答性聚合物部分以0.8 3.0y g/cm2的比例進行被覆。另外，本專利技術的細胞培養用應答性基材，雖沒有限定，但作為優選方式包含下述的方式。在本專利技術的一方式中，在基材表面上作為水不溶性聚合物部分以0.09 7.0ii g/cm2的比例進行被覆。在本專利技術的一方式中，基材表面具有相分離結構。在本專利技術的一方式中，嵌段共聚物內的溫度應答性聚合物的含量為30 90wt%。在本專利技術的一方式中，嵌段共聚物內的溫度應答性聚合物的平均分子量為3000以上。另外，如圖2表示的那樣，重均分子量(Mw)與數均分子量(Mn)的比接近1，因此為了得到本專利技術的效果，可采用任意的平均分子量。在本專利技術的一方式中，溫度應答性聚合物，包含聚N-取代丙烯酰胺衍生物、聚N-取代甲基丙烯酰胺衍生物、它們的共聚物、聚乙烯基甲基醚的任一個或兩個以上。在本專利技術的一方式中，溫度應答性聚合物為聚N-異丙基丙烯酰胺。在本專利技術的一方式中，其特征是基材為單獨的板狀、或2種以上組合的形態。另外，通過本專利技術，提供細胞培養用溫度應答性基材的制造方法，其特征在于，將具有水不溶性聚合物鏈段與溫度應答性聚合物鏈段結合的結構的嵌段共聚物溶解或分散于有機溶劑中，通過旋轉涂布將該嵌段共聚物溶液均勻地涂布于基材表面，并使其干燥。另夕卜，本專利技術的細胞培養用應答性基材的制造方法，雖沒有限定，但作為優選方式包含下述的方式。在本專利技術的一方式中，嵌段共聚物是通過可逆的加成斷裂鏈轉移(RAFT)聚合得到的。在本專利技術的一方式中，溶解嵌段共聚物的溶劑為乙腈與N，N-二甲基甲酰胺的混合液。在本專利技術的一方式中，乙腈與N，N-二甲基甲酰胺的混合溶劑的混合比例按照體積比計為5:1。專利技術效果通過使用本專利技術的細胞培養用溫度應答性基材，可效率良好地培養細胞，而且僅通過改變基材面的溫度即可效率良好地剝離培養細胞或細胞片。另外，通過本專利技術，可簡便地制作這樣的功能性表面。附圖說明圖1:是表示實施例1的嵌段共聚物的合成經路的圖。圖2:是表示實施例1中得到的嵌段共聚物的特性的圖。圖3:是表示實施例1中得到的溫度應答性表面的特性的圖。通過ATR/FT-1R測定來評價溫度應答性聚合物修飾量與被覆膜的穩定性。圖4:是表示實施例1中得到的溫度應答性表面的特性的圖。通過PIPAAm固定量與靜的接觸角測定(水中氣泡法)來評價表面潤濕性。圖5:是表示實施例1中得到的各修飾量的溫度應答性表面與細胞舉動的關系的圖。圖6:是表示實施例1中得到的各修飾量的溫度應答性表面與細胞舉動的關系的照片。其表示在TCPS (A)上、以及TCPS上分別用將B79-1P120以0.本文檔來自技高網...

【技術保護點】

【技術特征摘要】
【國外來華專利技術】2010.08.31 JP 208506/20101.一種細胞培養用溫度應答性基材，在基材表面被覆有嵌段共聚物，所述嵌段共聚物具有水不溶性聚合物鏈段與溫度應答性聚合物鏈段結合的結構，在基材表面作為溫度應答性聚合物部分以0.8 3.0 i! g/cm2的比例進行被覆。2.根據權利要求1所述的細胞培養用溫度應答性基材，其中，在基材表面作為水不溶性聚合物部分以0.09 7.0 ii g/cm2的比例進行被覆。3.根據權利要求1或2所述的細胞培養用溫度應答性基材，其中，基材表面具有相分離結構。4.根據權利要求1 3的任一項所述的細胞培養用溫度應答性基材，其中，嵌段共聚物內的溫度應答性聚合物含量為30 90wt%。5.根據權利要求1 4的任一項所述的細胞培養用溫度應答性基材，其中，嵌段共聚物內的溫度應答性聚合物的平均分子量為3000以上。6.根據權利要求1 5的任一項所述的細胞培養用溫度應答性基材，其中，溫度應答性聚合物包含聚N-取代丙烯酰胺衍生物、聚...

【專利技術屬性】
技術研發人員：中山正道，岡野光夫，
申請(專利權)人：學校法人東京女子醫科大學，
類型：
國別省市：