使用光的核酸的擴增抑制方法和高靈敏度的選擇性核酸擴增方法技術

本發明專利技術提供在核酸樣品中，檢測野生型核酸組中微量混雜的突變型核酸時，快速而簡便、且兼具高特異性和靈敏度的方法。在本發明專利技術方法中，使具有靶位點的核酸、與包含具有與靶位點互補的序列的光連接性核酸類的發夾探針共存，通過光照射使該具有靶位點的核酸與該發夾探針進行光連接，抑制由核酸擴增法引起的包含靶位點的檢測區的擴增。

【技術實現步驟摘要】
【國外來華專利技術】
本專利技術涉及使用包含光連接性核酸類的發夾探針(clamp probe)選擇性地檢測例如野生型核酸中混雜的突變型核酸的方法和試劑盒、以及具有350 380nm范圍的波長的光照射功能的核酸擴增裝置。
技術介紹
人基因組序列解讀完畢后，將所解讀的基因信息有效用于診斷等醫療領域的活動進行活躍。解讀基因組序列之后，接下來所關注的是基因表達模式分析或基因中的單堿基替換(一塩基置換)(SNPs)的分析等。研究在各種條件下表達的基因的表達量或基因突變，由此基因的功能或基因與疾病或藥物感受性的關聯日益明朗，因此與所累積的基因有關的信息不僅被用于疾病的診斷，還被用于治療方法的選擇。其中，單核苷酸多態性(一塩基多型)或突變成為疾病診斷或風險判定等基因檢查中的重要目標，在涉及糖尿病、風濕病、惡性腫瘤、精神疾病、心臟病等多個方面的領域應用。作為該單堿基替換的檢測方法，迄今為止開發了各種方法。具體而言，作為快速且高通量地進行分析的方法，可以列舉:Invader法、SniPer法、TaqMan PCR法、雜交探針法、SNPIT法、焦磷酸微測序法(Pyrominisequencing法)、變性高效液相色譜(DHPLC)法、MALD1-T0F/MS 法、NanoChip 法等。在惡性腫瘤領域，狙擊體內的特定分子以抑制其功能的分子靶向治療藥的開發在積極進行，選擇治療方法時，在確定分子靶向治療藥的使用上，單堿基替換的檢測被定位成重要的檢查。例如，推薦在使用抗癌藥前實施EGFR基因或KRAS基因的突變分析檢查。其原因在于:根據是否存在突變，在藥效上存在差異，因此考慮突變以指導給藥。另外，通過事先研究是否存在這樣的突變，與藥物的有效性相比，還存在著選擇發生嚴重的副作用的危險性大、給藥效果差的患者的目標。根據這樣的理由，在惡性腫瘤領域，特別是單堿基替換的檢測被視為重要的檢查。但是，在惡性腫瘤這樣的后發突變的檢測中，由于以來自占據多半檢體材料的正常細胞的野生型核酸分子為背景(background)，因此在上述的分析方法中，往往無法檢測單堿基替換等的突變。為了解決這個問題，人們開發了 Scorpion-ARMS法或PNA-LNA PCRClamping法(專利文獻I)。Scorpion-ARMS法是指，利用以突變點位于引物的3’末端附近的方式與突變型序列一并制備的該引物和另一個引物的組合，選擇性地擴增突變型分子，再通過Scorpion法這種熒光檢測法分析該擴增產物的方法。PNA-LNA PCR Clamping法是指，利用設計在突變點上的與野生型序列互補的發夾引物選擇性地封閉(block)野生型分子，以突變型LNA作為熒光檢測探針，選擇性地擴增并檢測突變型分子的方法。上述方法均利用已形成雜交體(〃 4 7'.； 'y K )的引物或探針和模板分子在平衡系統中的熱穩定性之差， 無論是在引物或探針與模板分子完全互補的情況下形成雜交體、還是在引物或探針與模板分子有I個或多個堿基不互補的情況下形成不完全的雜交體，其不同之處也不過是熱穩定性的不同。因此，區別兩者的適當的條件根據目標堿基序列而不同，即使在更適當的條件下，使熱穩定性發生變化的條件對兩者幾乎均等地發揮作用。即，只要是僅以平衡系統中的雜交體形成的熱穩定性之差作為區別兩者的原理，就無法設定在特異性和靈敏度的均衡上妥協的溫度條件，而且尚需說明的是，可以設定的溫度條件的范圍往往非常窄，因此，存在著根據基因序列難以設計探針或引物的情形。鑒于上述檢測技術的狀況，目前在惡性腫瘤的突變檢測檢查中，對檢查材料的采集設有嚴密的限制。具體而言，推薦由癌癥組織制作病理標本，再由染色標本鑒定腫瘤部位，之后由連續切片的未染色標本只集中在腫瘤部分(關于大腸癌患者的KRAS基因突變測定的指南)。但是，在腫瘤部位的鑒定中，需要組織形態學的專業知識、且操作繁雜，而且在成本方面負擔大。因此，人們要求確立不怎么受作為檢查要件的檢查材料的采集或靶基因的堿基序列所帶來的限制、且兼具特異性和靈敏度的檢測方法。作為兼具特異性和靈敏度的檢測方法，人們開發了利用光連接性核酸類的突變基因的檢測方法。例如，專利文獻2中記載著:基于使特定的堿基序列的靶核酸與互補鏈形成雜交體的原理，同時兼具高特異性和靈敏度來進行檢測的方法。其依據于下述方法:由與靶核酸互補的光連接性核酸類和在3’末端或5’末端具有可以與該光連接性核酸類進行光連接的堿基部分的被光連接性核酸類構成，且該核酸類中的任一方具有標記部分、而剩下的一方被固定在基材上的方法。根據該方法，位于同一條鏈上的光連接性核酸類和被光連接性核酸類利用光連接只在形成完全的雜交體時特異性地進行光連接，可以將具有標記部分的核酸分子以共價鍵固定在基材上，可以在互補的雙鏈發生解離的條件下進行徹底的清洗，可以兼具高特異性和靈敏度(S/N比)。但是，在檢測靈敏度上有限度，該方法的使用目的在于:檢測包含在大量的靶核酸中的突變是否存在，但為了 檢測大量的野生型核酸中混雜的微量突變型核酸，該微量的突變型核酸的存在量往往在檢測靈敏度以下，因此無法使用。另外，由于光連接性核酸類與同鏈的被連接核酸形成共價鍵，因此還無法擴增想要檢測的靶核酸中所含的突變。另一方面，專利文獻3中記載著下述方法:首先，通過PCR擴增包含靶核酸的樣品，對于該樣品，結合專利文獻2的方法，檢測核酸樣品中的具有I個或2個以上的靶核苷酸序列的核酸。當突變型核酸的比例為微量時，即使通過PCR可以擴增，但與野生型核酸的含有比例也不會發生變化，通過在試管內可以進行檢測的范圍的擴增，無法將突變型核酸擴增至可以檢測的程度。該方法的使用目的在于:檢測包含在大量的靶核酸中的突變是否存在，但無法用于檢測大量的野生型核酸中混雜的微量突變型核酸。另外，為了通過PCR擴增包含靶核酸的樣品，只要在某種程度上提高突變型核酸的含有比例，就有可能檢測到突變型核酸，但步驟多、繁雜，無法滿足要求快速的檢查結果的臨床現場的迫切需要。現有技術文獻 專利文獻 專利文獻1:日本專利第4216266號說明書； 專利文獻2:W02007/058326號公報； 專利文獻3:日本特開2009-213445號公報。
技術實現思路
專利技術所要解決的課題 本專利技術的目的在于提供:在核酸樣品中，檢測野生型核酸組中微量混雜的突變型核酸時，快速而簡便，且兼具高特異性和靈敏度的方法。解決課題的方法 本專利技術人為了解決上述課題反復進行了深入研究，結果發現:通過將包含光連接性核酸類的發夾探針與具有靶位點序列的野生型核酸進行光連接，可以選擇性地阻止野生型核酸的擴增，所述光連接性核酸類具有與具有野生型核酸的序列的靶位點互補的序列。即，通過使用光連接性發夾探針，只在形成完全的雜交體時特異性地進行光連接，在核酸擴增反應中的溫度循環的任一個步驟中也保持連接、即處于非平衡狀態，從而可以阻止靶分子在核酸擴增反應中作為模板的作用。由此，可以兼具野生型核酸的高聚集(々9 > C 7，clumping)(抑制)效果和突變型核酸的選擇性(特異性)核酸擴增。本專利技術涉及下述[I] [15]: [1]使具有靶位點的核酸、與包含具有與靶位點互補的序列的光連接性核酸類的發夾探針共存，通過光照射使該具有 靶位點的核酸與該發夾探針進行光連接，抑制由核本文檔來自技高網...

【技術保護點】

【技術特征摘要】
【國外來華專利技術】2010.09.10 JP 2010-2030541.使具有靶位點的核酸、與包含具有與靶位點互補的序列的光連接性核酸類的發夾探針共存，通過光照射使該具有靶位點的核酸與該發夾探針進行光連接，抑制由核酸擴增法引起的包含靶位點的檢測區的擴增的方法。2.突變型核酸的檢測方法，該方法是通過選擇性地擴增包含突變型核酸的靶位點的檢測區，來檢測是否存在該突變型核酸，該方法包括下述步驟: 步驟(a):使包含光連接性核酸類的發夾探針與核酸樣品共存，使發夾探針與具有靶位點的野生型核酸分子特異性地形成雜交體，所述光連接性核酸類具有與具有野生型核酸序列的靶位點互補的序列； 步驟(b):對已形成雜交體的發夾探針和靶核酸分子進行光照射，使之進行光連接； 步驟(C):將上述步驟(a)、(b)的反應產物供給核酸擴增反應； 步驟(d):分析上述擴增產物。3.突變型核酸檢測方法，該方法是通過選擇性地擴增包含突變型核酸的靶位點的檢測區，來檢測是否存在該突變型核酸，該方法包括下述步驟: 步驟(a):使包含光連接性核酸類的發夾探針與核酸樣品共存，使發夾探針與具有靶位點的野生型核酸分子特異性地形成雜交體，所述光連接性核酸類具有與具有野生型核酸序列的靶位點互補的序列； 步驟(b):對已形成雜交體的發夾探針和靶核酸分子進行光照射，使之進行光連接； 步驟(C):在核酸擴增反應中進行上述步驟(a)、(b)； 步驟(d):分析上述擴 增產物。4.權利要求1 3中任一項所述的方法，其中，上述核酸擴增法為PCR法。5.權利要求1 3中任一項所述的方法，其中，上述核酸擴增法為實時PCR法。6.權利要求1 3中任一項所述的方法，其中，上述發夾探針具有與靶核酸分子的有義鏈和/或反義鏈互補的序列。7.權利要求1 6中任一項所述的方法，其中，上述發夾探針的鏈長為7 30。8.權利要求1 7中任...

【專利技術屬性】
技術研發人員：寺崎浩司，今野玄理，島津光伸，藤本健造，坂本隆，
申請(專利權)人：三菱化學美迪恩斯株式會社，
類型：
國別省市：