慢病毒載體的半穩定生產制造技術

本發明專利技術提供新的半穩定包裝細胞系以及使用所述半穩定包裝細胞系而產生慢病毒載體(LV)的方法。用baculo-AAV雜合系統產生本發明專利技術的新方法和包裝細胞系，用于慢病毒結構蛋白和調控蛋白的穩定表達，所述系統包含含有側翼為AAVITR的整合盒的桿狀病毒骨架，以及編碼rep蛋白的質粒。該系統允許得到HIV-1的結構蛋白和調控蛋白gag/pol和rev的穩定整合。所述系統允許得到包含HIV的結構蛋白和調控蛋白gag/pol和rev的細胞系，用于半穩定LV生產。

【技術實現步驟摘要】
【國外來華專利技術】
本專利技術涉及用于基因治療的慢病毒載體(LV)的生產。更具體地講，本專利技術涉及半穩定慢病毒包裝細胞系以及使用雜合桿狀-腺伴隨病毒(baculo-Adeno associated virus(AAV))載體而制備包裝細胞系的方法，用于慢病毒結構蛋白和調控蛋白的穩定整合。直量 自從2001年針對AIDS的首次LV I期臨床試驗之后，研究基于HIV的LV作為基因遞送載體的38個1-1I期和2個I1-1II期試驗已經經過當局的審查；它們中的3個仍然處于審查中。最大數量的試驗包括單基因病，其中的一些具有高發病率，例如庫利氏貧血(Cooley’ s anemia) β -重型地中海貧血(4個試驗)。其次是癌癥和感染性疾病,主要是HIV-1感染。通常，Ι/II期試驗中招募的患者數量是有限的，但在III期中則不是。因此迫切需要第2代(基于LTR)和第3代(基于SIN) LV的穩定包裝細胞系，以應付LV大規模生產的需要，大量用于未來有希望的III期試驗。基于瞬時方案的LV生產在全局應用的安全性、成本和再現性的觀點來看確實是不現實的。越來越多的證據顯示，新近開發的用于基因治療的病毒整合載體LV具有廣泛應用性，可轉導終末分化的或處于周期中的細胞，對維持長期轉基因表達是理想的并且比先前畏懼的更安全。在過去20年里對莫洛尼鼠白血病病毒(MoMLV) Y-逆轉錄病毒載體(YRV)積累的經驗指導了 LV遞送系統的快速發展，其開發起源于克服逆轉錄病毒不能轉導非分裂細胞(non diving cell)的需要。具體地講，自失活(SIN)轉移載體的產生使得在人類臨床試驗中大量使用LV的前景更可行\只要發展和優化同樣有效的制備方法。然而，與通過若干人類和鼠的市售包裝細胞系就可制備的Y RV相反，不僅用于研究級、而且用于GMP級的目前的LV生產幾乎都通過瞬時轉染。該技術昂貴，難以標準化和規模化并且需要大量下游驗證試驗。此外，與穩定生產相比，在瞬時生產期間可能通過包裝和轉移載體構建體中病毒序列間的重組而產生的復制型慢病毒(RCL)的風險，是雖罕見但可能性較高的事件。用于LV的與逆轉錄病毒等效的穩定包裝細胞系的開發變得更緩慢和更困難，因為，與Y逆轉錄病毒相反，慢病毒蛋白例如env、蛋白酶和某些輔助蛋白的表達對于人體細胞而言是有毒的。為了克服該問題，在包裝細胞的很早期形式中存在的輔助基因，之后在最新一代中被去掉。第一代基于SIV和HIV的LV包裝細胞系得自猴Vero，或人C0S、HeLa和293的貼壁細胞2_5，其經工程化具有攜帶極少關鍵性修飾的慢病毒基因組，例如除去了包裝信號。事實上gpl20 env和大部分輔助基因都保留下來。所得LV滴度非常低2_5，而且更重要的是這些載體的可能應用必定限制在⑶4+ T細胞，對于抗AIDS基因治療方法而言。隨后，gpl20 env被來源于皰疹性口炎病毒的糖蛋白(VSV-G)取代并且去掉了所有輔助基因，因為已經證明對于有效LV制備而言是可有可無的。為了避免對VSV-G也描述過的毒性，通過各種不同系統，例如Tet、脫皮素、Rev以及Tet和cumate的組合,有條件地誘導其表達 6。同樣，為了在克隆選擇期間降低病毒蛋白酶的毒性效應，已經描述了經Tet以及強力霉素和cumate藥物組合誘導的gag-pol基因的有條件的表達6。在所有這些系統中,通過質粒DNA瞬時轉染而整合gag-pol基因、rev基因和env基因,然后藥物選擇和細胞克隆。為了實現真實的穩定包裝細胞系的一個關鍵性問題就是選擇最好的病毒基因遞送載體。大部分研究人員通過質粒DNA瞬時轉染而整合gag-pol基因、rev基因和env基因，然后藥物選擇和細胞克隆2Λ已知該技術隨時間推移而遭受基因沉默和基因損失1(|，這二者均可危害包裝克隆的長期穩定性。已經公開了替代的基因遞送載體，尤其是在STAR11和在新近開發的GPRG-TL-2012包裝細胞系中，其中通過MLV-穿梭載體將gag基因、pol基因和rev基因整合到HEK293T細胞中。2拷貝重新編碼的gag-pol基因穩定地整合在STAR中，而對于GPRG-TL-20則沒有這類信息12。與轉染env基因的STAR相反，在GPRG-TL-20中所有殘留病毒基因都通過SIN-MLV而引入。存在若干系統，允許外源基因組穩定整合到宿主細胞中。Palombo等，199813公開了雜合桿狀病毒-AAV載體，用于專門整合到宿主細胞中。這樣的載體看來非常有效，如果它在同一雜合桿狀病毒-AVV載體中包含r印基因的話。該文獻中未提到本專利技術的構建體，更別說提出使用這類系統用于LV生產了。在過去的大約20年里，進行了若干嘗試以產生穩定的LV包裝細胞系。盡管公開了不同技術，但目前在臨床試驗中都未使用這些包裝細胞系，也沒有上市。因此需要用于大規模生產LV的新系統，其是產能有效的并且是安全、成本效果劃算和可重復的。專利技術概沭 本專利技術涉及LV生產領域。若干基因治療的臨床試驗正在進行中，使用LV作為基因遞送載體。在所有這些試驗中，LV的生產仍然基于瞬時方案。本專利技術提供了產生基于Hiv-1的包裝細胞系的新策略。這樣的策略是基于使用:雜合載體，其包含含有 側翼為AAV反向末端重復序列(ITR)的整合盒的桿狀病毒骨架，即所謂的baculo-AAV雜合系統；以及編碼rep蛋白的質粒。該系統允許獲得HIV-1結構蛋白和調控蛋白gag/pol和rev的穩定整合。本專利技術的系統包括a) baculo-AAV雜合載體，其特征在于它含有2個表達盒，一個編碼慢病毒gag基因和pol基因，另一個編碼慢病毒rev基因和選擇標記，和b)編碼rep蛋白的質粒。所提出的系統代表遞送HIV結構蛋白和調控蛋白的一種新的有利方式，以便用慢病毒結構蛋白穩定而有效地改造宿主細胞。使用該系統，獲得僅包含HIV結構蛋白和調控蛋白gag/pol和rev的第一中間體,用于半穩定LV生產，或作為起點，以得到任選包含調控蛋白(Tat)和目標包膜蛋白的第2代和第3代包裝細胞系，以及也包含轉移載體的生產用細胞系。第一中間體攜帶以三-順反子構型表達Hiv-1 gag-pol基因和rev基因的2拷貝重組baculo-AAV包裝構建體。這樣的中間體被稱為PK-7并在實施例中稱為PK-7。已知是ITR-介導的AAV載體整合所必需的AAV Rep78蛋白的瞬時表達促進了 baculo-AAV包裝載體的基因組整合14。這樣的第一中間體對于I年培養物而言顯示出具有令人吃驚的遺傳穩定性，證明在殘留遺傳元件的瞬時轉染之后的功能性LV的連續生產。另外，在這類細胞中未觀察到沉默現象。此外，通過對非編碼的基因間轉錄活性區中的2個串聯整合的包裝AAV載體的整合位點的精確作圖，我們提供了針對可能的危險基因激活的安全性理由，所述危險基因的mRNA可結合到LV中并最終結合到宿主靶細胞中。已開發的基于使用雜合baculo-AAV載體而用于慢病毒gag-pol和rev穩定表達的包裝系統被稱為“MolPack”。本專利技術所用的表達系統有利地允許僅在一輪轉染和克隆中穩定而安全地引入HIV的結構蛋白(gag/pol)和調控蛋白(rev)。目前用于臨床試驗的LV生產仍然是基于所有所需蛋白的瞬時轉染。相比之下，用本專利技術表達本文檔來自技高網...

【技術保護點】

【技術特征摘要】
【國外來華專利技術】2010.09.02 EP 10175088.31.一種用于慢病毒結構蛋白和調控蛋白的穩定表達的系統，其由以下組成: i.雜合載體，其包含含有側翼為AAVITR并包含2個表達盒的整合盒的桿狀病毒骨架，其中第一表達盒編碼慢病毒gag基因和pol基因，第二個編碼慢病毒rev和選擇標記，和 i1.含有處于啟動子控制之下的AAV rep可讀框(ORF)的表達質粒。2.權利要求1的系統，其中所述雜合載體的2個表達盒是尾-尾的方向并且每個由組成型啟動子和多聚A驅動。3.權利要求1或2的系統，其中所述啟動子選自CMV、CMVIE、PGK、SV40、eFl a、SFFV和 RSV。4.權利要求1-3中任一項的系統，其中所述啟動子是CMVIE啟動子。5.前述權利要求中任一項的系統，其中所述選擇標記選自潮霉素、卡那霉素、新霉素、zeomycin的抗性基因。6.權利要求5的系統，其中所述選擇標記是潮霉素抗性基因。7.前述權利要求中任一項的系統，其中所述選擇標記是克隆在內部核糖體進入位點(IRES)下游。8.前述權利要求中任一項的系統，其中所述rep蛋白是rep78。9.一種由穩定表達慢病毒gag、pol和rev的細胞組成的半穩定慢病毒包裝細胞系，其特征在于這類細胞含有穩定整合到其基因組中的側翼為AAV ITR并包含2個表達盒的至少一個拷貝的整合盒，其中第一表達盒編碼慢病毒gag基因和pol基因，第二個編碼慢病毒rev和選擇標記。10.權利要求9的半...

【專利技術屬性】
技術研發人員：C博沃倫塔，A斯托爾納約洛，P里扎爾迪，F馬維利奧，
申請(專利權)人：莫爾梅德股份有限公司，
類型：
國別省市：