本發(fā)明專利技術(shù)涉及合成或動物來源的3維（3D）生物支架作為基體用于提高hPS（人類多能干細胞）的生長和分化的應(yīng)用；這些支架適合與現(xiàn)有的細胞培養(yǎng)實驗室塑料器皿一起使用。更具體地說，本發(fā)明專利技術(shù)涉及用hPS細胞接種單獨的或具有各種生物基質(zhì)涂層的這些支架，以提高所述hPS細胞分化成肝細胞或肝細胞樣細胞類型。本發(fā)明專利技術(shù)還涉及將部分分化的肝細胞祖細胞接種到支架上，以進一步分化成更成熟的肝細胞細胞類型。
【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】
【國外來華專利技術(shù)】
本專利技術(shù)涉及合成或動物來源的3維(3D)生物支架作為基體用于提高hPS (人類多能干細胞)的生長和分化的應(yīng)用；這些支架適合與現(xiàn)有的細胞培養(yǎng)實驗室塑料器皿一起使用。更具體地說，本專利技術(shù)涉及用hPS細胞接種單獨的或具有各種生物基質(zhì)涂層的這些支架，以提高所述hPS細胞分化成肝細胞或肝細胞樣細胞類型。本專利技術(shù)還涉及將部分分化的肝細胞祖細胞接種到支架上，以進一步分化成更成熟的肝細胞類型。
技術(shù)介紹
哺乳動物細胞培養(yǎng)多年來，哺乳動物細胞培養(yǎng)方法已被改善和標準化，并且允許細胞生長、擴增和分化所需要的條件已被充分確定。細胞可以在無菌塑料表面例如聚苯乙烯上常規(guī)培養(yǎng)，所述塑料表面往往與基質(zhì)涂層一起使用，所述基質(zhì)涂層被設(shè)計成更接近地重現(xiàn)細胞會正常生長的體內(nèi)環(huán)境。在胚胎干細胞的情況下，往往需要飼養(yǎng)細胞層例如小鼠胚胎成纖維細胞層來為營養(yǎng)和支持所述細胞的·增殖提供更好的基體。典型地，哺乳動物細胞被培養(yǎng)在通常含有添加劑例如胎牛血清的支持性培養(yǎng)基中，所述培養(yǎng)基除了向細胞提供各種激素和生長因子之外，還含有同樣有助于復現(xiàn)細胞生長的理想微環(huán)境的許多細胞基質(zhì)組分。當前，哺乳動物細胞培養(yǎng)具有各種各樣的下游應(yīng)用，包括它們在基礎(chǔ)研究中的應(yīng)用、它們在藥物和毒理學分析中的應(yīng)用和它們在產(chǎn)生正確折疊的重組哺乳動物蛋白中的應(yīng)用。最近，哺乳動物細胞培養(yǎng)已被進一步開發(fā)用于再生醫(yī)學領(lǐng)域，由此獲取組織例如皮膚真皮層并將其增殖一定的時間段，以便生成更大量的組織以供臨床外科用，例如修復外傷性損傷之后的傷口或修復患病的內(nèi)臟器官。可是，從原代來源獲得的細胞在它們進一步增殖的能力方面往往非常有限，并需要復雜的生長培養(yǎng)基配方和生長條件來進行成功培養(yǎng)。由于免疫排斥的問題，它們在再生醫(yī)學中的應(yīng)用也有限。最近，在旨在越過這些障礙的胚胎干細胞研究領(lǐng)域中有許多進展。這種多能干細胞不僅能夠幾乎無限地增殖，它們還具有分化成構(gòu)成完全發(fā)育的生物體的每種細胞和組織類型的能力。因此，多能干細胞在開發(fā)新藥的試驗中可能是重要的工具，并且因為它們的供應(yīng)實際上是無限的，因此它們提供了更廉價并且可變性較少的來源。3D生物支架多能干細胞分化中的主要挑戰(zhàn)之一是控制分化，使得始終產(chǎn)生成熟、功能完全的細胞類型而不是部分分化、不成熟的前體細胞或各種細胞類型的高度異質(zhì)性混合物。使多能干細胞分化的最簡單方式是在2D塑料基體上，但不幸的是，這往往產(chǎn)生缺乏成熟細胞類型的特征性表型的分化細胞。這部分是由于不能復現(xiàn)干細胞在正常胚胎發(fā)生期間所經(jīng)受的條件，正常胚胎發(fā)生過程與2D培養(yǎng)物的不同之處在于它當然是在3維中發(fā)生的。研究人員試圖解決這個問題的一種方式是開發(fā)新的3D培養(yǎng)系統(tǒng)，所述新的3D培養(yǎng)系統(tǒng)旨在更忠實地復現(xiàn)細胞在胚胎發(fā)生期間所經(jīng)受的一些條件并讓它們以更天然的方式分化。特別是，這樣的3D系統(tǒng)允許細胞在更大的程度上彼此相互作用，并允許開發(fā)比利用2D細胞培養(yǎng)觀察到的任何物體更類似于功能性器官的復雜的多細胞聚集體。3D系統(tǒng)依賴于生物活性支架的存在，細胞可以接種并可以粘著在所述支架上。這樣的支架必須有助于引導細胞以所需的3D構(gòu)造生長和增殖，并且也可能需要提供幫助細胞形成所需結(jié)構(gòu)的某些分子信號。生物支架的另一個重要要求是它們是可放大的，以便組織生長和細胞分化可以在更大、更經(jīng)濟的規(guī)模上進行。支架可以由各種材料構(gòu)成，正確的支架選擇在引導接種到其上的任何細胞的生長、增殖和分化中可能是關(guān)鍵的。例如，支架通常由安排成多孔海綿形式的聚合材料構(gòu)成。于是，接種到這種支架中的細胞可以通過支架內(nèi)部相互連接的管道和通道網(wǎng)絡(luò)在所述支架的孔結(jié)構(gòu)內(nèi)部粘著和生長，當選擇適合的支架時，孔徑是重要的考慮因素。生體活性劑例如細胞外基質(zhì)(ECM)組分，在沉積到支架表面上時，也可以用來增強支架功能，以容許更好的細胞粘著。最終的結(jié)果是為細胞提供一種體外環(huán)境，使細胞可以在其中更切實可行地并且以更接近地類似于它們正常的體內(nèi)家園的方式進行相互作用。在幾種培養(yǎng)系統(tǒng)中，添加細胞外基質(zhì)誘導細胞極性和組織的組織化。例如，當用第二層膠原蛋白進一步覆蓋培養(yǎng)在平的膠原蛋白層上的單層原代肝細胞時，即所謂的夾心培養(yǎng)，與常規(guī)2D培養(yǎng)物的肝細胞相比，所述細胞顯示出形態(tài)和功能改善(Dunn，J.等，1991)。所述覆蓋層導致細胞保持肌動蛋白絲與體內(nèi)狀態(tài)相似，與此相反，在2D對照培養(yǎng)中看到異常的應(yīng)激纖維形成(Berthiaume，F(xiàn).等，1996)。生理更相關(guān)的細胞骨架組織化和隨后的細胞極性與形狀可能引起肝功能性提高，但是后來認為，夾心培養(yǎng)的有益效應(yīng)主要起因于改善的細胞-細胞接觸而不是細胞與細胞外基質(zhì)的接觸(Hamilton, G.等,2001)。膠原蛋白支架也已被用于將胚胎干細胞分化成肝細胞。Baharvand和同事發(fā)現(xiàn)，與傳統(tǒng)2D中分化的細胞相比，肝細胞樣細胞在膠原蛋白支架內(nèi)部的分化改善了形態(tài)特征、基因表達模式和代謝活性(Baharvand, H.等，2006 )。藻酸鹽提供了多孔非粘著 性3D支架，支持肝細胞聚集形成強烈的細胞-細胞相互作用，導致肝功能改善(Dvir-Ginzberg, M.等,2003)。藻酸鹽基質(zhì)中的環(huán)境還支持新生大鼠肝細胞的分化(Dvir-Ginzberg, M.等,2008)和 HepG2 成熟(Elkayam, T.等,2006)為更成熟的功能性表型。另外，當將C3A肝細胞系作為球狀體在藻酸鹽中進行培養(yǎng)時，因為許多不同CYP的酶活性比在2D單層培養(yǎng)中增加，因此，C3A肝細胞系顯示出藥物代謝提高(Elkayam, T.等,2006)。最近,市場上已推出幾種用于提供3D支架以支持細胞培養(yǎng)的新產(chǎn)品，包括已被發(fā)現(xiàn)改善肝細胞培養(yǎng)條件的3D交織納米纖維支架(Wang, S.等,2008)。另夕卜，多孔聚苯乙烯支架提供了空間，能夠讓細胞生長和分化并形成具有復雜的3D細胞-細胞相互作用的層(Bokhari, M.等,2007a ;Bokhari, M等,2007b)。在這些支架中，HepG2響應(yīng)于生化試劑的方式遠比在2D中培養(yǎng)的細胞更加類似于體內(nèi)組織的活性(Bokhari, M.等，2007a)。另外，小鼠ES細胞在灌流的聚氨酯泡沫中已作為球狀體成功地向肝細胞分化，目的在于通過組合生長因子處理和多細胞球狀體形成來發(fā)展大量分化培養(yǎng)法(massdifferentiation culture method) (Matsumoto, K.等，2008)。肝細胞培養(yǎng)肝功能衰竭和終末期肝臟疾病在全世界造成為數(shù)巨大的死亡并且是醫(yī)療保健系統(tǒng)的主要負擔。肝臟移植仍然是最成功的治療。可是，這種方法的功效有限并且與許多并發(fā)癥例如感染或排斥關(guān)聯(lián)。肝臟移植還具有可利用的供體器官短缺的缺點，并且被治療的患者往往需要終身免疫抑制治療。通過減少對器官的需要，基于細胞的治療對于社會和患有這些嚴重疾病的個體都將是極為重要的。此外，肝臟是人體中代謝和解毒的中心，因此為了鑒定用于體外試驗的功能性細胞類型的可靠來源，已經(jīng)進行了大量的嘗試。不幸的是，目前可利用的任何細胞類型都不能真實反映肝臟的復雜性和功能。從hPS細胞生成肝細胞樣細胞的方法往往包括胚狀體的形成和/或基于添加細胞毒性化合物進行早期選擇，所述肝細胞樣細胞可以進一步分化成成熟肝細胞(Rambhat I a, L.等,2003)。這些選擇步驟,特別是胚狀體的形成,往本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護點】
【技術(shù)特征摘要】
【國外來華專利技術(shù)】2010.06.11 DK PA201000515;2010.06.11 US 61/353,6781.關(guān)于將人類多能干細胞(hPS)或肝細胞前體細胞分化成肝細胞祖細胞、肝細胞樣細胞或成熟肝細胞的方法，所述方法包括以下步驟: i)在2維表面上接種和生長hPS或肝細胞前體細胞以起始分化 ii)將步驟i)的初始分化的細胞轉(zhuǎn)移到3維(3D)支架上用于進一步分化和成熟。2.權(quán)利要求1的方法，其中細胞在3D支架上的接種密度高于在2D培養(yǎng)物上的接種密度，例如高三倍或高五倍或高十倍。3.權(quán)利要求1的方法，其中在細胞存活因子例如ROCKRho激酶抑制劑的存在下接種細胞。4.述權(quán)利要求任一項的方法，其中在無飼養(yǎng)細胞的條件下執(zhí)行步驟i)或ii)中的至少一個。5.述權(quán)利要求任一項的方法，其中在無異源的條件下執(zhí)行步驟i)或ii)中的至少一 個。6.述權(quán)利要求任一項的方法，其中hPS細胞或肝細胞前體細胞是無異源的細胞，例如來源于無異源的hPS細胞系。7.述權(quán)利要求任一項的方法，其中hPS細胞是人類胚胎干(hES)細胞。8.述權(quán)利要求任一項的方法，其中hPS細胞是誘導的多能干(iPS)細胞。9.權(quán)利要求1-6任一項的方法，其中肝細胞前體細胞是定型內(nèi)胚層(DE)細胞。10.權(quán)利要求1-6任一項的方法，其中肝細胞前體細胞不是定型內(nèi)胚層(DE)細胞。11.權(quán)利要求1-6任一項的方法，其中肝細胞前體細胞具有胚胎內(nèi)胚層的特征。12.權(quán)利要求1-6任一項的方法，其中肝細胞前體細胞具有肝內(nèi)胚層的特征。13.述權(quán)利要求任一項的方法，其中在2至25天、例如4至15天之后，將步驟i)中獲得的細胞轉(zhuǎn)移到3D支架上(步驟ii)。14.述權(quán)利要求任一項的方法，其中3D支架選自下列之一: i)多孔藻酸鹽海綿 ii)可生物降解的聚氨酯脲(PUUR)聚合物 iii)乳液模板型聚苯乙烯 iv)合成納米纖維復合物 V)具有至少一個非直立側(cè)壁的微孔裝置 vi)由聚L-乳酸[PLLA]制造的多孔海綿。15.權(quán)利要求14的方法，其中3D支架是孔徑為50-200μ M的多孔藻酸鹽海綿。16.權(quán)利要求14的方法，其中3D支架是孔徑在0.11000 μ Μ、例如15-45 μ M范圍內(nèi)的乳液模板型聚苯乙烯支架。17.述權(quán)利要求任一項的方法，其中3D支架是未涂覆的。18.權(quán)利要求1-16任一項的方法，其中用一種或多種細胞外基質(zhì)組分預(yù)先涂覆3D支架。19.權(quán)利要求18的方法，其中一種或...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：楊內(nèi)·延森，
申請(專利權(quán))人：塞拉帝思股份公司，
類型：
國別省市：
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