本發明專利技術涉及一種發酵法制備維生素B12的方法，包括發酵、水解、過濾、氰化物轉化、結晶、干燥等過程，尤其是氰化物轉化過程所用的氰基化合物為鐵氰絡合物，其反應濃度為200-4000ug/ml，且反應體系的PH值為3.0-8.0，反應溫度為50-120℃，反應時間為0.5-6小時。本發明專利技術制備方法克服了目前普遍使用NaCN轉化維生素B12所存在的環境污染、工藝復雜、生產成本高、轉化收率低等一系列的缺點。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及一種發酵法制備維生素B12的方法，具體地說，涉及一種維生素B12的提取方法。
技術介紹
維生素B12 (Vitamin B12)又稱氰鈷胺素(Cyanocobalamin)，也稱為動物蛋白因子，是一類含有類似氰鈷胺素維生素活性物質的總稱。它是唯一含有金屬離子的水溶性維生素，又是人體必需的維生素之一。維生素B12的分子式為C63H88CoN14O14P,其熔點很高(320°C時不熔)，無臭無味，極易吸潮，晶體吸水后在空氣中穩定。維生素B12溶于水，難溶于乙醇，不溶于丙酮、氯仿和乙醚，遇強光可分解，在210 220°C高溫下會變色，在強酸性或強堿性環境中可分解。維生素B12是比較特殊的一種維生素，大多數植物性食品中不含維生素B12，主要存在于動物組織中。維生素B12是人體組織代謝過程中必需的維生素，是人和其它哺乳動物維持生長和促進紅細胞生長的重要因子，具有廣泛的生理作用，如參與體內甲基轉換及葉酸代謝，促進神經髓鞘中脂蛋白的形成，保持中樞神經和外周髓鞘神經纖維的功能完整。臨床上用于治療惡性貧血和恢復造血功能，也用于神經系統疾病如多發性神經炎、末梢神經麻痹等?？傊?，維生素B12是一種人體必需的維生素，其生理功能及營養作用正日漸引起全社會的普遍關注。目前我國維生素B12的應用面較窄，主要是醫藥用。在國外，維生素B12除用于醫藥方面(約占全部消費量40%左右)以外，還大量應用于營養補充劑和食品加工方面(約占全部消費量的24%左右)，如維生素口服液、維生素強化面粉、嬰兒食品等。因此我國的維生素B12應用于食品行業相關產品的市場發展空間很大，可以借鑒發達國家的經驗，開發添加維生素B12等多種維生素的營養食品、保健食品等，這樣既能改善人們的營養狀況和提高人們的身體素質，又能促進維生素B12相關食品行業的發展與進步。雖然Woodward已于1973年以非常出色的工作完成了 Vitamin B12的全化學合成，但目前工業上仍然主要是利用細菌培養液發酵生產維生素B12。以謝氏丙酸桿菌的厭氧發酵工藝為例，其基本提取流程如下: 發酵液—_ — I板框過濾I — I濾餅調漿I — I加熱水解I — I板框過濾1->大孔樹脂吸附1-> I乙醇解吸1-1氰化鈉轉化1-1大孔樹脂吸附kl丙酮解吸I—氧化鋁層析1-m-1真空干燥I一成 品目前，發酵法生產維生素B12的研究重點主要集中在菌株的選育、優化以及發酵工藝、設備的改進等方面。如專利W02003018826 “制備維生素B12的方法”公開了一種用巨大芽孢桿菌制備維生素B12的方法，主要涉及厭氧條件下巨大芽孢桿菌的發酵工藝。專利CN200510119016.5 “酶催化生產腺苷輔酶維生素B12的方法”公開了一種酶催化生產腺苷輔酶維生素B12的方法:利用三磷酸腺苷一維生素B12腺苷轉移酶生產腺苷輔酶維生素B12，其中的羥鈷型維生素B12使用的終濃度為0.001-0.05mol/l。該方法具有工藝簡潔、生產周期短、生產成本低的特點。利用本專利技術中的生產工藝獲得的終產物腺苷輔酶維生素B12純度高、穩定性強，可加工成多種劑型，為藥用腺苷輔酶維生素B12的大規模生產提供了一條新途徑。Nakano 等人(Nakano K, Kataoka H, M at sum ura M.High density culture ofPropionibacterium freudenreichii coupled with propionic acid removal systemwith activated charcoal .Ferment Bioeng, 1996,81 (I):37-41.)建立了由旋轉陶瓷膜濾器、活性炭填裝柱和發酵罐組成的發酵體系。膜濾器和活性炭填裝柱可用于去除丙酸和回收重復使用的發酵細胞和培養基，菲氏丙酸桿菌在發酵罐內的發酵液先經旋轉陶瓷膜過濾，濾液再進入裝填柱，最終的透過液里已不再含有丙酸，可以循環回到發酵罐中重復使用，丙酸和乙酸也可回收成為副產品。與傳統的發酵法相比，菲氏丙酸桿菌和糖類等營養物質的利用率都大大提高了，減少了基質的浪費，可進一步降低成本，有利于實際生產的應用和推廣。用發酵法生產維生素B12，大多指生產氰基型維生素B12 (又稱氰鈷胺素)。在發酵液和生產維生素B12菌體細胞內，B12的存在形式主要是腺苷輔酶型B12及少量其它型B12，為了把腺苷輔酶等B12轉化成氰基B12，必須使用氰化物，目前普遍使用的氰化物為NaCN，它是劇毒品，在生產過程中存在著職工中毒的安全隱患；產生的廢液中有大量的游離氰根，為了環保達標，須加入大量的NaClO進行廢水處理；產生的廢渣也屬危險化學品，須焚燒處理,這樣不僅污染環 境,并且增加了生產成本。對于上述問題，雖然專利CN200810008004.9 “一種菌體提取物及其制備方法”實現了維生素B12發酵生產廢水的零排放:以維生素B12發酵生產廢水為原料，經過乳酸菌、酵母菌和芽胞桿菌的發酵過程后將其制備成微生態制劑產品，并將該產品用于無公害農業領域，開辟出了維生素B12廢水的一種新用途，變廢為寶。但是，上述方法仍然無法避免制備過程中NaCN的使用。
技術實現思路
本專利技術提供了一種發酵法制備維生素B12的新方法，具體地說，是一種維生素B12的提取方法。該方法是指在發酵液的氰化物轉化過程中，用化學性質穩定的鐵氰絡合物代替現有技術中普遍使用的氰化鈉，在整個使用過程和生產過程中，不產生對人體、環境有害的物質，廢水廢渣不用進行氰離子的回收處理，簡化了生產工藝，降低了生產成本，并且氰基維生素B12的轉化率高于NaCN方法。鐵氰絡合物轉化的具體操作過程為:向維生素B12的發酵液中加入鐵氰絡合物水溶液，使其反應濃度為200-4000ug/ml。用稀H2S04水溶液調節反應體系的PH值為3.0-8.0，然后將其全部轉移至反應瓶中，再滴入2滴消沫劑，控制反應溫度為50-120°C，在磁力攪拌反應器中反應0.5-6小時。上述轉化過程中的發酵液也可以是發酵濾液或其濃縮液。本專利技術所述鐵氰絡合物最好是六氰合鐵(II)酸四鉀。眾所周知，NaCN法轉化工藝是把腺苷輔酶B12及其它型B12先轉為雙氰B12或亞硝基B12、磺酸基B12，最后再全部轉成氰基B12，因多次轉化，其轉化率會降低。而本專利技術氰基B12的轉化工藝簡單，生產過程安全，生產條件溫和，對環境無污染，使用的原材料價格低廉，具有較高的社會效益和經濟效益。本專利技術實驗過程中維生素B12的含量用高壓液相色譜儀進行測定。具體實施例方式原材料及試劑: I發酵液本實驗中所用的發酵液是指將用于生產維生素B12的脫氮假單孢菌(Pseudomonas denitrificans),經常規工藝發酵、水解、過濾后,所得的濾液,其所含維生素B12的主要類型是腺苷輔酶型維生素B12。2鐵氰絡合物水溶液、NaCN水溶液、亞硝酸鈉水溶液。儀器與設備I高壓液相色譜(Lc-1OA型)色譜柱:C18L= 30cm d = 3.9mm流動相:甲醇和水的比例為30 %壓力:p= 2500psi溫度:40°C流速:F= lml/min進樣體積:20ul波長:36Inm2磁力攪拌器(85_2型)3全自動機械攪拌不銹鋼發酵系統(⑶本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種發酵法制備維生素B12的方法，包括發酵、水解、過濾、氰化物轉化、結晶、干燥等過程，其特征在于，氰化物轉化過程所用的氰基化合物為鐵氰絡合物，其反應濃度為200?4000ug/ml，且轉化過程中反應體系的PH值為3.0?8.0，反應溫度為50?120℃，反應時間為0.5?6小時。
【技術特征摘要】
【專利技術屬性】
技術研發人員：馮勝利，牛瑞昕，
申請(專利權)人：馮勝利，
類型：發明
國別省市：河北;13
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