本發明專利技術公開了檢測雞IGFBP-3基因第二號外顯子的單核苷酸多態性的檢測方法，其特征是包括如下步驟：設計雞IGFBP-3基因第二外顯子區域PCR引物；以引物P進行PCR擴增待測雞的IGFBP-3基因片段；MspI酶切反應消化PCR擴增的IGFBP-3基因片段；MspI消化PCR產物后聚丙烯酰胺凝膠電泳分析；進行雞IGFBP-3基因SNP位點的頻率統計分析；進行雞IGFBP-3基因SNP位點基因效應的關聯分析。本發明專利技術的優點是：通過設計特定的引物PCR擴增特定的限制性內切酶酶切鑒定，能夠快速、簡單、低成本、高精確地檢測其單核苷酸的多態性；能夠從分子遺傳學上快速的對種質資源進行分型，以便用于雞產蛋性狀的標記輔助選擇（MAS），快速建立遺傳優良的雞種群。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于分子遺傳學領域，涉及基因單核苷酸多態性(SNP)的檢測，特別涉及一種檢測雞IGFBP-3基因第二號外顯子的單核苷酸多態性的檢測方法。
技術介紹
單核苷酸多態性(SNP)就是指在基因組水平上由單個核苷酸的變異所引起的DNA序列多態性。包括單堿基的轉換、顛換、插入及缺失等形式，其中最少出現的I種等位基因頻率不小于1%。堿基突變分為轉換(嘌呤-嘌呤或嘧啶-嘧啶)和顛換(嘌呤-嘧啶)2種。在原則上，突變處的堿基可以為A、T、C、G，但事實上SNP多發生在C和T 2個堿基之間。SNP在單個基因或整個基因組的分布是不均勻的。SNP在非轉錄序列要多于轉錄序列，而且在轉錄區非同義突變(有氨基酸序列的改變)的頻率，比其他方式突變的頻率低得多。Halushka等(1999)通過對75個基因檢測，推測人類基因組有百萬個SNP位點，其中大約有50萬個在非編碼區，SNP的頻率在基因的5'端非編碼區、3'端非編碼區、內含子、沉默位點及編碼區有顯著差異(P = 6.6X10,)，突變熱點CpG的頻率在這5種區域中也存在顯著差異(P = 0.025)。在群體遺傳研究中，SNP作為新一代的遺傳標記，有以下特點:(1)數量多且分布廣泛:據估計，基因組中大約平均每1000 bp就會出現I個SNP，這樣它們在整個基因組的分布就會達到300萬個，遺傳距離為2 3 CM，密度比微衛星標記更高，可以在任何一個待研究基因的內部或附近提供一系列標記；(2)富有代表性:某些位于基因內部的SNP有可能直接影響蛋白質結構或表達水平，因此它們可能代表疾病遺傳機理中的某些作用因素；(3)遺傳穩定性:SNP是基因組中分布最廣泛且穩定的點突變，突變率低，與微衛星等重復序列多態標記相比，SNP具有更高的遺傳穩定性，尤其是處于編碼區SNP; (4)檢測快速，易于實現自動化:SNP通常是I種雙等位基因的遺傳變異，在檢測時無需像檢測微衛星標記那樣對片段的長度做出測量，只需一個“+ /- ”或“全或無”分析的方式，有利于自動化篩選或檢測SNP; (5)堿基的轉換大于顛換:因為基因組中大多數C是甲基化的，能夠自發的脫氨基產生T。因此SNPs作為遺傳標記在群體遺傳和生物進化中有重要意義。目前已經確定有7種IGFBPs (IGFBPl-7) ,IGFBP-3,是其中重要的一種，它是血液中最豐富的IGmPs結合形式，血液中95%的IGF-1和IGF- II都與IGmP-Z結合,IGFBPS有延長IGF半衰期、調節IGF的生物學活性等作用，故IGFBPS對IGFs功能的發揮有很大影響，從而間接地影響畜禽的生長發育、繁殖性能及肉的品質等。目前，畜禽基因多態性研究主要集中在牛和羊上。雞IGFBP-3基因遺傳變異領域的研究匱乏，該基因位點的功能研究及其遺傳變異與家禽經濟性狀(如:體重、開產日齡、開產蛋重、開產體重、產蛋數等性狀)關聯的研究仍是空白
技術實現思路
本專利技術的目的是:針對上述不足，提供一種檢測雞IGFBP-3基因第二號外顯子的多態性的檢測方法。同時設計其與生產性狀進行關聯分析，驗證其是否可以作為雞分子育種輔助選擇中的分子標記。為實現上述目的，本專利技術采用的技術方案是: 檢測雞IGFBP-3基因第二號外顯子的單核苷酸多態性的檢測方法，包括如下步驟: 一、設計雞IGFBP-3基因第二外顯子區域PCR引物 以NCBI所公布的雞NC_006089序列為參考，設計能夠擴增包含雞IGFBP-3基因第二外顯子區域的引物P，其序列如下: 上游引物為:CATCTTGGGACCAGTGCTTT 20 ； 下游引物為:ATTTTTCAAGCCTGCTGTGG 20 ； 二、以引物P進行PCR擴增待測雞的IGFBP-3基因片段 a、雞樣本的采集 采集多個地方的雞種作為檢測對象，以包含雞IGFBP-3基因的待測雞全基因組DNA為模板； b、待測雞全基因組DNA模板處理 對上述含雞IGFBP-3基因的待測雞全基因組DNA模板進行分離、提取、純化； c、PCR擴增雞IGFBP-3基因片段 PCR反應體系采用混合加樣法，加入到I個1.5ml離心管中，充分混勻后瞬時離心，再分裝到每個96孔平板中，然后加入經過步驟b處理后的待測雞全基因組DNA模板，再瞬時離心后進行PCR擴增，所述PCR反應體系總量為19一25 μ L，其包括10 X PCR Buffer 2.0—3.0μ L、濃度為 25mmol/L 的 Mg2+ 2.2—2.5 μ L，濃度為 2 mmol/L 的 dNTPs 0.8 —1.5 μ L，濃度為10 pmol/μ L的上、下游引物各I μ L，濃度為5 U/mL的TaqDNA聚合酶0.2 — 0.6 μ L，濃度為100 ng/yL的DNA模板1.0— 1.5 μ L，超純水11.8—12.5 μ L，擴增程序為:控制溫度為92— 96 V，對PCR反應體系進行預變性處理4一6 min,保持溫度在92— 96 V，變性處理50— 70 S，然后降低溫度至54— 58 °C，進行退火處理20— 40 S，退火處理完畢后，升高溫度至70— 74 V，再進行延伸處理20— 40s，將上述的變性處理——退火處理——延伸處理三個步驟按上述的順序和工藝要求重復30— 35個循環，操作完成后控制溫度為70—74 V，延伸處理9一 10 min,再降低溫度至9一 10 V，對PCR反應體系進行保存； 三、MspI酶切反應消化PCR擴增的IGFBP-3基因片段 MspI酶切反應消化體系包括4.6—5.2 μ L PCR產物，限制性內切酶MspI5U，IOXBuffer 0.8—1.1 μ L，雙蒸水5—6 μ L，酶切消化條件為:65°C恒溫水浴消化6—8h ； 四、MspI消化PCR產物后聚丙烯酰胺凝膠電泳分析 a、制作濃度為10%的聚丙烯酰胺凝膠，點樣后采用180V電壓電泳25—35min，電泳結束后EB染色； b、待分子量不同的待測雞全基因組DNA分離清晰時，在柯達凝膠成像系統成像； C、根據聚丙烯酰胺凝膠電泳結果分析SNP多態性； 根據聚丙烯酰胺凝膠電泳結果鑒定雞IGFBP-3基因第1087位的單核苷酸多態性為:CC型表現為95bp和66bp兩條條帶，CT基因型表現為161bp、95 bp和66 bp三條條帶，TT基因型表現為161bp —條條帶；d、不同基因型個體PCR產物測序的序列驗證 對不同基因型個體PCR產物分別進行正反雙向測序，同時，進行SNP位置分析； 五、進行雞IGFBP-3基因SNP位點的頻率統計分析； 六、進行雞IGFBP-3基因SNP位點基因效應的關聯分析 第1087位點的TT基因型可以作為一個提高雞產蛋數的候選分子遺傳標記。與現有技術相比，本專利技術公開的雞IGFBP-3基因的第1087位的SNP多態性，是一個與雞部分生產性狀密切相關的單核苷酸多態位點，本專利技術對4個雞品種的SNP基因型進行了檢測和基因頻率分析，對上述SNP位點與雞部分經濟重要性狀(產蛋數)進行關聯分析，結果表明該位點能夠作為提高雞產蛋數的分子標記； 本專利技術的優點是:本專利技術針對上述第1087位的SNP多態性，通過設計特定的引物PCR擴增特定的限制性內本文檔來自技高網...
【技術保護點】
檢測雞IGFBP?3基因第二號外顯子的單核苷酸多態性的檢測方法，其特征是包括如下步驟：一、設計雞IGFBP?3基因第二外顯子區域PCR引物以NCBI?所公布的雞NC_006089序列為參考，設計能夠擴增包含雞IGFBP?3基因第二外顯子區域的引物P，其序列如下：上游引物為：CATCTTGGGACCAGTGCTTT??20；下游引物為：ATTTTTCAAGCCTGCTGTGG??20；二、以引物P進行PCR擴增待測雞的IGFBP?3基因片段a、雞樣本的采集采集多個地方的雞種作為檢測對象，以包含雞IGFBP?3基因的待測雞全基因組DNA為模板；b、待測雞全基因組DNA模板處理對上述含雞IGFBP?3基因的待測雞全基因組DNA模板進行分離、提取、純化；c、PCR擴增雞IGFBP?3基因片段PCR反應體系采用混合加樣法，加入到1個1.5ml離心管中，充分混勻后瞬時離心，再分裝到每個96孔平板中，然后加入經過步驟b處理后的待測雞全基因組DNA模板，再瞬時離心后進行PCR擴增，所述PCR反應體系總量為19—25μL，其包括10×PCR?Buffer?2.0—3.0μL、濃度為25mmol/L的Mg2+??2.2—2.5μL，濃度為2?mmol/L的dNTPs?0.8—1.5μL，濃度為10?pmol/μL的上、下游引物各1μL，濃度為5?U/mL的TaqDNA聚合酶0.2—0.6μL，濃度為100?ng/μL的DNA模板1?.0—1.5μL，超純水11.8—12.5μL，擴增程序為：控制溫度為92—96?℃，對PCR反應體系進行預變性處理4—6?min，保持溫度在92—96?℃，變性處理50—70?s，然后降低溫度至54—58?℃，進行退火處理20—40?s，退火處理完畢后，升高溫度至70—74?℃，再進行延伸處理20—40s，將上述的變性處理——退火處理——延伸處理三個步驟按上述的順序和工藝要求重復30—35個循環，操作完成后控制溫度為70—74?℃，延伸處理9—10?min，再降低溫度至9—10?℃，對PCR反應體系進行保存；三、MspI酶切反應消化PCR擴增的IGFBP?3基因片段?MspI酶切反應消化體系包括4.6—5.2μL?PCR產物，限制性內切酶MspI5U，10×Buffer?0.8—1.1?μL，雙蒸水5—6?μL，酶切消化條件為：65℃恒溫水浴消化6—8h；四、MspI消化PCR產物后聚丙烯酰胺凝膠電泳分析a、制作濃度為10%的聚丙烯酰胺凝膠，點樣后采用180V電壓電泳25—35min，電泳結束后EB染色；b、待分子量不同的待測雞全基因組DNA分離清晰時，在柯達凝膠成像系統成像；c、根據聚丙烯酰胺凝膠電泳結果分析SNP多態性；根據聚丙烯酰胺凝膠電泳結果鑒定雞IGFBP?3基因第1087位的單核苷酸多態性為：CC型表現為95bp和66bp兩條條帶，CT基因型表現為161bp、95?bp和66?bp三條條帶，TT基因型表現為161bp一條條帶；d、不同基因型個體PCR產物測序的序列驗證對不同基因型個體PCR產物分別進行正反雙向測序，同時，進行SNP位置分析；五、進行雞IGFBP?3基因SNP位點的頻率統計分析；六、進行雞IGFBP?3基因SNP位點基因效應的關聯分析第1087位點的TT基因型可以作為一個提高雞產蛋數的候選分子遺傳標記。...
【技術特征摘要】
1.檢測雞IGFBP-3基因第二號外顯子的單核苷酸多態性的檢測方法，其特征是包括如下步驟: 一、設計雞IGFBP-3基因第二外顯子區域PCR引物 以NCBI所公布的雞NC_006089序列為參考，設計能夠擴增包含雞IGFBP-3基因第二外顯子區域的引物P，其序列如下: 上游引物為:CATCTTGGGACCAGTGCTTT 20 ； 下游引物為:ATTTTTCAAGCCTGCTGTGG 20 ； 二、以引物P進行PCR擴增待測雞的IGFBP-3基因片段 a、雞樣本的采集 采集多個地方的雞種作為檢測對象，以包含雞IGFBP-3基因的待測雞全基因組DNA為模板； b、待測雞全基因組DNA模板處理 對上述含雞IGFBP-3基因的待測雞全基因組DNA模板進行分離、提取、純化； c、PCR擴增雞IGFBP-3基因片段 PCR反應體系采用混合加樣法，加入到I個1.5ml離心管中，充分混勻后瞬時離心，再分裝到每個96孔平板中，然后加入經過步驟b處理后的待測雞全基因組DNA模板，再瞬時離心后進行PCR擴增，所述PCR反應體系總量為19一25 μ L，其包括10XPCR Buffer 2.0—3.0μ L、濃度為 25mmol/L 的 Mg2+ 2.2—2.5 μ L，濃度為 2 mmol/L 的 dNTPs 0.8 —1.5 μ L，濃度為10 pmol/μ L的上、下游引物各I μ L，濃度為5 U/mL的TaqDNA聚合酶0.2 — 0.6 μ L，濃度為100 ng/yL的DNA模板1.0— 1.5 μ L，超純水11.8—12.5 μ L，擴增程序為:控制溫度為92— 96 V，對PCR反應體系進行預變性處理4一6 min,保持溫度在92— ...
【專利技術屬性】
技術研發人員：俞亞波，王金玉，顧云飛，顧玉萍，金崇富，邱聰，施會強，張跟喜，
申請(專利權)人：江蘇京海禽業集團有限公司， 揚州大學，
類型：發明
國別省市：江蘇;32
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