一種滅活雞新城疫疫苗的制備方法技術

本發明專利技術涉及一種滅活雞新城疫疫苗的制備方法，包含病毒液滅活、復方中藥提取物的制備、水相制備、油相制備、乳化步驟。該制備方法將復方中藥提取物作為免疫增強劑添加到滅活的雞新城疫疫苗中，可引起較好的細胞免疫應答，能增強機體的免疫功能，使抗體提早產生，并明顯提高抗體滴度。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及屬于獸用生物制品培育
，涉及，具體涉及一種將復方中藥提取物作為免疫增強劑添加到滅活雞新城疫疫苗中制備滅活雞新城疫疫苗的方法。
技術介紹
免疫增強劑是指與抗原同時或預先應用，能增強機體針對抗原的免疫應答能力，或改變免疫反應類型的物質。現存生物性、細菌性、化學性、營養性的免疫增強劑中，許多具有較好的佐劑活性，但是還存在許多弊端。鋁鹽佐劑雖然能吸附抗原緩慢釋放，較長時間刺激免疫細胞，增強機體的體液免疫反應，但也有許多不足，不適用于許多新型疫苗。首先鋁鹽佐劑不能凍干，其次其制備的鋁膠批次間差異很大，既難以控制質量，又難以對佐劑效果作出準確評價，再次鋁鹽佐劑主要刺激相關抗體的產生，不能刺激細胞活性，即只能增強體液免疫，不能增強細胞免疫，而且會增加超敏反應的危險；弗氏完全佐劑是細胞免疫的強刺激劑，弗氏不完全佐劑能刺激體液免疫，這兩種佐劑均能引起慢性肉芽腫和潰瘍，且有對結核菌素致敏以及潛在的致癌作用等毒副作用，限制了其使用范圍；細胞因子類免疫增強齊U，如IL-2、FIN等雖然有較好的免疫增強效果，但是生產成本很高，雖作用產生快，但持續時間短，而且它們畢竟是外源性的免疫物質，對機體有不同程度的影響，長期使用還會降低機體對其的敏感性；其他一些微生物類免疫增強劑以及脂質體等均存在多方面的缺陷和不足，研制開發安全有效的新型免疫增強劑是非常必要的。我國中藥資源豐富、品種繁多。據報道，我國中草藥的品種達12807種，其中植物藥11146種，動物藥1581種，礦物藥80種，居世界之首；其中近200種中草藥具有免疫活性。中藥的來源天然性和安全可靠性是舉世公認的特點。中藥的許多復方、單味乃至有效成分都具有免疫增強作用。近年來國內外學者對中藥成分進行了廣泛的研究，發現中藥的多種成分具有免疫增強作用，例如，多糖類成分能提高機體細胞免疫和體液免疫功能，促進干擾素、白細胞介素、腫 瘤壞死因子等細胞因子的產生，增強紅細胞免疫功能，提高NK細胞、LAK細胞的活性；皂苷類成分能激活T淋巴細胞、巨噬細胞，提高抗體水平，促進細胞因子的表達，調節神經內分泌免疫網絡功能；黃酮類成分能增強或調節機體免疫功能，還具有抗腫瘤、抗病毒及防治自身免疫病等作用，因而完全可以開發為新型免疫增強劑。研究表明，從中草藥中提取的多糖，如甘草多糖、人參多糖、黃芪多糖、刺五加多糖、牛膝多糖、香菇多糖、靈芝多糖、豬苓多糖、云芝多糖、當歸多糖等相繼被報道具有免疫增強作用；甙類，如人參皂甙、黃芪皂甙、白芍總甙、淫羊藿甙、雷公藤甙、大豆皂甙等都有免疫增強作用；生物堿及揮發性成分，如苦豆草中分離到的總生物堿及大蒜中提取的大蒜素，都能增強巨噬細胞的吞噬功能；小檗堿、大黃素、丹參素、甘草酸激活單核巨噬細胞分泌炎性細胞因子，從而增強機體的免疫功能；目前廣泛應用的大豆異黃酮等均具有免疫增強作用。復方中藥提取物用作免疫增強劑制備滅活雞新城疫疫苗，尚未見報道。
技術實現思路
本專利技術提供了，具體為一種將復方中藥提取物作為免疫增強劑添加到滅活雞新城疫疫苗中制備滅活雞新城疫疫苗的方法。該疫苗免疫激發功能更強，免疫效力更強，免疫持續期更長。本專利技術是通過下述的技術方案來實現的: ，包含如下步驟: (a)病毒液滅活 (al)制備病毒液:將新城疫種毒稀釋后，搖勻，尿囊腔內接種SPF雞胚，每胚接種0.1ml，置37°C孵化器繼續孵育，收獲48 120h死胚及120h后活胚的尿囊液于無菌容器中，取樣后置_20°C凍結保存； (a2)滅活:將結凍保存的胚液化凍，澄清過濾處理后滅活，未凍結保存的直接滅活，分別向胚液桶內加入40%甲醛溶液，隨加隨搖，使其充分混合，甲醛溶液的最終濃度為0.2%，然后在37°C滅活24 26小時，期間振搖5 6次； (a3)滅活阻斷:將過濾除菌的50%硫代硫酸鈉溶液加入滅活病毒液中，使硫代硫酸鈉溶液的終濃度為2%，充分混勻后，置5°C保存，同時取樣進行滅活檢驗； (b)復方中藥提取物的制備 (bl)提取:將復方中藥洗凈烘干后，經粉碎、過篩，得到40 80目的中藥粉末；將中藥粉末與蒸餾水按重量1: 4的比例混合后浸泡I 2小時，并在溶液溫度55 65°C、超聲波功率150瓦下，超聲提取40-50分鐘； (b2)精制:將上述提取液過濾，對上清液減壓濃縮至原體積的1/3 1/2，向濃縮液中加入95%以上的乙醇，加入量為濃縮液體積的5-8倍，常溫靜置2 4小時，獲得沉淀物；最后，將沉淀物冷凍干燥，粉碎得到復方中藥提取物粉末； (C)水相制備:將復方中藥提取物加到滅活好的病毒液中，混勻，得混合溶液，備用；取混合溶液96份，加入0.01%的疊氮鈉和0.015%的氧氟沙星晃勻，然后加入20 30°C左右的吐溫一 80 4份，充分振搖，使吐溫一 80完全溶解為止，得水相，備用； (d)油相制備:取注射用白油94份，加硬脂酸鋁0.5份，混合后，加司班-80 6份，121 °C30min高壓滅菌，得油相，備用； (e)乳化:將油相打入乳化罐中，開動混合機低速轉動攪拌，同時加入水相，加完后提轉速乳化30 lOOmin，即得滅活雞新城疫疫苗。步驟(b )中所述的復方中藥提取物的中藥選自黃芪、枸杞、刺五加、甘草、當歸中的任意兩種或幾種。本專利技術制備方法制備的滅活雞新城疫疫苗免疫學價結果: 本專利技術制備方法制備的滅活雞新城疫疫苗，通過RBC-C3bR花環、RBC-1C花環、淋巴細胞數量及ND抗體水平進行評價，本專利技術制備方法制備的滅活雞新城疫疫苗與常規疫苗的效果差異十分明顯: ①本專利技術制備方法制備的滅活雞新城疫疫苗RBC-C3bR花環(6.96±0.166)比常規疫苗組(5.16±0.283)高，與常 規疫苗相比差異顯著(0.01 < P < 0.05)。②本專利技術制備方法制備的滅活雞新城疫疫苗RBC-1C花環(6.35±0.176)比常規疫苗組(7.64±0.220)低，與常規疫苗相比差異顯著(0.01 < P < 0.05)。③本專利技術制備方法制備的滅活雞新城疫疫苗淋巴細胞數量(15.56±4.05)比常規疫苗組(29.37±6.14)低，與常規疫苗相比差異極顯著(P < 0.01)。④本專利技術制備方法制備的滅活雞新城疫疫苗ND抗體比常規疫苗組產生早，且比其高約21og2。分析結果可見，對新城疫滅活疫苗來講，本專利技術制備方法制備的滅活雞新城疫疫苗可引起較好的細胞免疫應答，能增強機體的免疫功能，使抗體提早產生，并明顯提高抗體滴度。由此說明，在新城疫滅活疫苗方面，復方中藥提取物作為免疫增強劑的效果明顯優于常規佐劑。具體實施例方式下面結合具體實施例對本專利技術作更進一步的說明，以便本領域的技術人員更了解本專利技術，但并不因此限制本專利技術。將病毒液加入復方中藥提取物，混合后作為抗原，按常規方法加入油佐劑乳化即可獲取滅活疫苗。實施例1:滅活雞新城疫疫苗的制備 (a)病毒液滅活: (al)制備病毒液:將新 城疫種毒稀釋后，搖勻，采用自動接種機尿囊腔內接種SPF雞胚，每胚接種0.1ml，置37°C孵化器繼續孵育，收獲48 120h死胚及120h后活胚的尿囊液于無菌容器中，取樣后置_20°C凍結保存； (a2)滅活:將結凍保存的胚液化凍，澄清過濾處理后滅活，未凍結保存本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種滅活雞新城疫疫苗的制備方法，包含如下步驟：（a）病毒液滅活（a1）制備病毒液：將新城疫種毒稀釋后，搖勻，尿囊腔內接種SPF雞胚，每胚接種0.1ml，置37℃孵化器繼續孵育，收獲48～120h死胚及120h后活胚的尿囊液于無菌容器中，取樣后置?20℃凍結保存；（a2）滅活：將結凍保存的胚液化凍，澄清過濾處理后滅活，未凍結保存的直接滅活，分別向胚液桶內加入40%甲醛溶液，隨加隨搖，使其充分混合，甲醛溶液的最終濃度為0.2%，然后在37℃滅活24～26小時，期間振搖5～6次；（a3）滅活阻斷：將過濾除菌的50%硫代硫酸鈉溶液加入滅活病毒液中，使硫代硫酸鈉溶液的終濃度為2%，充分混勻后，置5℃保存，同時取樣進行滅活檢驗；（b）復方中藥提取物的制備（b1）提取：將復方中藥洗凈烘干后，經粉碎、過篩，得到40～80目的中藥粉末；將中藥粉末與蒸餾水按重量1∶4的比例混合后浸泡1～2小時，并在溶液溫度55～65℃、超聲波功率150瓦下，超聲提取40?50分鐘；（b2）精制：將上述提取液過濾，對上清液減壓濃縮至原體積的1/3～1/2，向濃縮液中加入95％以上的乙醇，加入量為濃縮液體積的5?8倍，常溫靜置2～4小時，獲得沉淀物；最后，將沉淀物冷凍干燥，粉碎得到復方中藥提取物粉末；（c）水相制備：將復方中藥提取物加到滅活好的病毒液中，混勻，得混合溶液，備用；取混合溶液96份，加入0.01%的疊氮鈉和0.015%的氧氟沙星晃勻，然后加入20～30℃左右的吐溫－80?4份，充分振搖，使吐溫－80完全溶解為止，得水相，備用；（d）油相制備：取注射用白油94份，加硬脂酸鋁0.5份，混合后，加司班?80?6份，121℃?30min高壓滅菌，得油相，備用；（e）乳化：將油相打入乳化罐中，開動混合機低速轉動攪拌，同時加入水相，加完后提轉速乳化30～100min，即得滅活雞新城疫疫苗。...

【技術特征摘要】
1.一種滅活雞新城疫疫苗的制備方法，包含如下步驟: (a)病毒液滅活 (al)制備病毒液:將新城疫種毒稀釋后，搖勻，尿囊腔內接種SPF雞胚，每胚接種0.1ml，置37°C孵化器繼續孵育，收獲48 120h死胚及120h后活胚的尿囊液于無菌容器中，取樣后置_20°C凍結保存； (a2)滅活:將結凍保存的胚液化凍，澄清過濾處理后滅活，未凍結保存的直接滅活，分別向胚液桶內加入40%甲醛溶液，隨加隨搖，使其充分混合，甲醛溶液的最終濃度為0.2%，然后在37°C滅活24 26小時，期間振搖5 6次； (a3)滅活阻斷:將過濾除菌的50%硫代硫酸鈉溶液加入滅活病毒液中，使硫代硫酸鈉溶液的終濃度為2%，充分混勻后，置5°C保存，同時取樣進行滅活檢驗； (b)復方中藥提取物的制備 (bl)提取:將復方中藥洗凈烘干后，經粉碎、過篩，得到40 80目的中藥粉末；將中藥粉末與蒸餾水按重量1: 4的比例混合后浸泡I 2小時，并在溶液溫度55 65°C、超聲波功率150瓦下，超聲提取40-50分鐘；...

【專利技術屬性】
技術研發人員：董新榮，郝圣峰，張靜，
申請(專利權)人：山東濱州沃華生物工程有限公司，
類型：發明
國別省市：