一種引物中部序列干擾PCR技術制造技術

“一種引物中部序列干擾PCR技術”，其特征是采用引物中部序列的一段不互補或同序堿基、引物分子內外反義干擾而競爭性地破壞引物間聚合來選擇性抑制引物二聚體(PD)擴增的改良PCR技術。所述引物中部序列干擾是指在常規設計原則優選的引物基礎上，選用一對引物中部序列(ID)平行不互補或同序技術、或/和引物加入ID反義修飾寡核苷酸(Oligo)干擾技術、或/和引物分子內ID反義Oligo干擾技術及其組合，僅干擾引物ID而不影響靶特異性擴增，最大程度分散引物對末端少數堿基配對氫鍵與末端外的堿基氫鍵合力，而選擇性抑制PD，使PCR體系內沒有PD累積。輔以礦物油封閉下的引物緩釋熱啟動及UDG預處理消除了PCR體系外產物氣霧膠污染，使核酸擴增可靠，實時熒光PCR定量準確。

【技術實現步驟摘要】

:本專利技術屬于分子生物學及分子檢驗領域的核酸擴增
，具體涉及通過引物對中部序列干擾而競爭性地破壞引物間聚合來選擇性抑制PCR非特異性擴增的

技術介紹
:核酸擴增的思想起源于1971年，發現遺傳密碼的Khorana曾提出了核酸體外擴增設想:“經過DNA變性，與合適的引物雜交，用DNA聚合酶延伸引物，并不斷重復該過程便可克隆tRNA基因”(K1印pe，1971, J.Molec.Biol., 56:341),然而由于當時不具備寡核苷酸合成、耐熱聚合酶、熱循環儀的條件限制了其發展。直到1983年，美國PE-Cetus公司人類遺傳研究室的Kary Mullis在研究核酸測序方法時產生了核酸擴增的靈感:于試管中模擬天然的DNA體內指數式復制過程。其基本原理:提供一種合適的條件一模板DNA，寡聚核苷酸引物，DNA聚合酶，合適的緩沖體系，DNA變性、復性及延伸的溫度與時間，就可成幾何級數地擴增已知兩端序列的一段DNA分子。經過一系列探索、發展和耐熱聚合酶、熱循環儀的專利技術、應用，Cetus公司于1987年申請了首個PCR專利技術專利(US Patent 4，683，202)。核酸擴增PCR反應由變性一退火一延伸三個基本反應步驟構成:①模板DNA的變性:擬擴增的模板DNA經加熱至94°C左右一定時間后，使模板DNA雙鏈或經PCR擴增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結合，為下輪反應作準備；②模板DNA與引物的退火(復性):模板DNA經加熱變性成單鏈后，溫度降至54°C左右，引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結合；③引物的延伸:升溫至72°C左右，DNA模板一引物結合物在耐熱DNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應原料，靶序列為模板，尊循堿基反向配對與半保留復制原則，按5’ -3’方向合 成一條新的與模板DNA鏈反向互補的半保留復制鏈，不斷重復循環變性一退火一延伸三過程，就可獲得更多的“半保留復制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環的模板。一般PCR進行30個循環就能將待擴目的基因呈指數擴增放大數百萬倍以上，超過30個循環引物二聚體非特異性擴增就極劇增加。反應最終的DNA擴增量可用Y=(I + x)n計算。Y代表DNA片段擴增后的拷貝數，X表示平⑴均每次的擴增效率，η代表循環次數。平均擴增效率的理論值為100%，但在實際反應有時效率達不到理論值。反應初期PCR產物逐漸增加，進入一定循環后靶序列DNA片段的增加呈指數形式即對數期，隨著擴增產物的累積及PCR成份的消耗，被擴增的DNA片段不再呈指數增加，而進入線性增長期或靜止期，達到“停滯效應”平臺期。隨著1985-1988年Saiki等從溫泉中分離的一株水生嗜熱桿菌(thermusaquaticus)中Taq耐熱DNA聚合酶的提取應用以及pfu、Vent、Tth等其它耐熱聚合酶的發現應用，PCR技術逐漸成熟、實用，并因其高靈敏度、操作簡便而快速傳播全世界，因而1989年稱為“PCR爆炸年”。PCR技術已成為生命科學領域最重要的核心基礎技術，Kary Mullis也因此榮獲1993年諾貝爾化學獎。在以后的二十年里，多達數十種PCR新改進，新方法不斷涌現，被專利技術，包括反轉錄 PCR (RT-PCR)，原位 PCR,連接酶鏈反應(Ligase chain reaction, LCR),標記PCR(Labeled primers, LP-PCR),反向 PCR(reverse PCR,擴增兩引物外側未知序列)，不對稱 PCR (asymmetric PCR),降落 PCR (touchdown PCR),重組 PCR (recombinant PCR),巢式 PCR (nest PCR)，多重 PCR (multiplex PCR)，免疫-PCR(immuno-PCR)，mRNA 差異 PCR，鏈替換擴增(Stranddisplacement amplification, SDA),依賴核酸序列的擴增(Nucleicacid sequence-basedamplification, NASBA),轉錄依賴的擴增系統(Transcript-basedamplification system, TAS), Q β 復制酶(Q-beta replicase)催化 RNA 擴增，滾環擴增(Rolling circle amplification, RCA),環介導的等溫擴增(Loop mediated isothermalamplification, LAMP)等，尤其是各種實時熒光PCR(Real-time PCR)技術的發展實現了從定性測定到精確定量的飛躍，如熒光染料SYBR Green I實時熒光PCR和各種熒光探針Taqman (Hydrolysisprobe), FRET Hybridition probes, andMolecular Beacons PCR,詳見綜述(Maisa L.Wong and Juan F.Medrano, BioTechniques39:75-85, July 2005)。核酸擴增技術不僅極大提升了基因克隆技術也提高了核酸檢測靈敏度、效率，PCR應用已拓展到生物學的眾多領域。PCR技術已不是單一技術方法，而是包括一系列理論、方法學及應用的新學科。詳細綜述于PCR書籍(黃留玉等“PCR最新技術原理、方法及應用”化學工業出版社2005年)，PCR廣泛應用于分子克隆、測序、基因重組、蛋白質工程等生命科學研究，及醫療、農林、畜牧、環保、食品等眾多檢測應用領域，已成為二十一世紀生物學最核心的基礎技術。近年來，在PCR基礎上為提高檢測效率而發展出了許多增加熱循環速度的快速微流體縮微PCR(lab-on-chip)和多重靶檢測的高通量納升PCR芯片(PCR-on_chip)，詳見論文SURVEYand SUMMARY, Da Xing (2007) Nucleic AcidsRes., Vol.35, N0.13，p4223_4237，截至目前全世界PCR專利或相關的設計更是多達三至四位數以上。繼上所述，常規終末檢測PCR只能定性分析，同樣濃度靶分子擴增終末產物量變化很大，靈敏度仍不夠，低于數千拷貝數標本測不了否則引物二聚體非特異性擴增導致假陽性結果，以及擴增產物汽霧膠再污染所致假陽性等難題，常規PCR加產物凝膠電泳檢測方法難以適用臨床檢驗等應用檢測。1992年Higuchi等首次提出了采用動態PCR方法和封閉式熒光檢測方式對目的基因數量進行分析，為解決傳統PCR的難題提出了新思路。實時熒光PCR定量分析是通過實時檢測擴增產物量(產物標記熒光強度)與起始靶基因量直接相關而定量。擴增產物量增加的熒光信號達到對數期的循環數為Ct值(Cycle threshold),其與靶模板起始拷貝數的對數存在負相關線性關系。即起始模板稀釋一倍達到同樣對數期熒光強度所需的擴增循環就要增加一個循環數(Ct)。擴增產物增加的信號既可通過產物DNA結合熒光染料顯示，如基于熒光染料SYBR Green I的實時熒光PCR (US Patent6，569，627);又可采用帶淬滅基團的熒光探針；和熒光標記引物來檢測。被淬滅的熒光探針即可以通過降解而激活，本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種引物中部序列干擾PCR技術，其共同特征是選取一對引物中間部分序列(IntermediateDomain,ID)進行各種技術干擾來破壞引物間聚合而選擇性抑制非特異性擴增的改良PCR技術,所述PCR技術改良是指一對中間部分ID不互補或同序的引物選取及ID干擾選擇性抑制其PCR體系內引物二聚體PD非特異性擴增反應和隔絕PCR系統外產物氣霧膠交叉污染的創新改進,所述引物中部序列干擾包括采用ID不互補或同序的天然序列引物,與引物ID互補的反義修飾堿基寡核苷酸,分子內加上與引物ID互補的反義修飾堿基嵌合引物等各種技術途徑,僅引物中部序列干擾不影響引物與靶基因特異性結合及特異性擴增效率,而選擇性地抑制優化引物PCR引物二聚體PD非特異性擴增，改善PCR應用上的非特異性根本局限。

【技術特征摘要】
2012.11.30 CN 201210506394.91.一種引物中部序列干擾PCR技術，其共同特征是選取一對引物中間部分序列(IntermediateDomain, ID)進行各種技術干擾來破壞引物間聚合而選擇性抑制非特異性擴增的改良PCR技術，所述PCR技術改良是指一對中間部分ID不互補或同序的引物選取及ID干擾選擇性抑制其PCR體系內引物二聚體H)非特異性擴增反應和隔絕PCR系統外產物氣霧膠交叉污染的創新改進，所述引物中部序列干擾包括采用ID不互補或同序的天然序列引物，與引物ID互補的反義修飾堿基寡核苷酸，分子內加上與引物ID互補的反義修飾堿基嵌合引物等各種技術途徑，僅引物中部序列干擾不影響引物與靶基因特異性結合及特異性擴增效率，而選擇性地抑制優化弓I物PCR弓I物二聚體H)非特異性擴增，改善PCR應用上的非特異性根本局限。2.一種引物中部序列干擾PCR技術，所述的引物中部序列特征是首先遵守一般常規引物設計所有原則基礎上，5’ -3’方向平行比對備選模板上下游引物序列，選擇一對中部偏3’端位置即離3’末端4-5個堿基起倒數5-9個堿基base不互補或同序的引物，引物對3’端之間還盡量避免2個或2個以上反向互補堿基，引物3’最末端I 2base避免之間任何單個反向互補堿基，其末端以堿基C或A結尾，如此一系列中部不互補/同序的引物對適用于所有引物對的基因擴增PCR方法，中部不互補/同序引物干擾能不同程度地減少PCR體系內引物二聚體H)非特異性擴增反應，與單鏈結合蛋白SSB聯用顯著增強SSB抑制PCR非特異性作用。3.根據權利要求2所述的一種引物中部序列干擾PCR技術，其特征是優選一對中部相同方向比對6-8base不互補或同序的引物能選擇性地干擾引物間聚合非特異性擴增，其中部同向不互補或同序堿基不夠時在不互補或同序左側/5’側人為突變一個堿基以增加一個不配對或同序堿基，或中間差一個時突變成不配對/同序， 如不互補或同序左側不好就再選擇其右側/3’側臨近堿基突變，中部不互補或同序區引入一個RNA堿基/2-F RNA修飾堿基來增加引物間負電荷斥力而輕度提升抑制H)非特異性；還要注意引物對3’末端倒數第二、三個堿基也不能是CG/GC序列(CG夾)，甚至單一引物本身3’末端倒數第二、三個堿基CG/GC序列(CG夾)自身間會增加H)非特異性。4.一種引物中部序列干擾 PCR技術，所述的中部序列干擾技術特征是與引物中部序列互補的反義修飾堿基寡核苷酸As Oligo競爭性地結合引物并干擾引物之間的結合，采用5-llbase末端封閉的化學修飾的“反義”堿基序列既不能充作PCR模板也不能作為引物，這種僅保留結合功能的反義寡核苷酸競爭性地結合引物中部序列ID而干擾引物間聚合，引物中部序列AsOligo干擾不影響引物與靶基因特異性結合及特異性擴增效率，僅選擇性地抑制優化引物PCR引物二聚體H)非特異性擴增，中部序列干擾As Oligo獨立應用于常規引物設計原則初步優化的引物PCR能不同程度減少體系內引物二聚體ro非特異性擴增反應；中部序列干擾As Oligo固相化還適用于引物緩釋熱啟動PCR。5.根據權利要求4所述的一種引物中部序列干擾PCR技術，其特征是優選離引物3’末端3base起的中部序列反向互補6-10base As Oligo,所述的反義寡核苷酸成份反義修飾喊基包括 2’ -0-Methyl (OMe) RNA、2’ -O-methoxy-ethyl (MOE) RNA、2’ -Amino-RNA、，2，-Fluoro_RNA、2，-0, 4，-C-methylene bridge RNA (LNA 鎖核酸)、和 PNA (妝核酸)、MorphoIino> N3’ ->N5’ Phosphoramidate,反義寡核苷酸米用1-8個修飾喊基與正常喊基間隔，其3’末端設修飾堿基終止延伸或3’端羥基封閉。6.一種引物中部序列干擾PCR技術，所述的中部序列干擾技術特征包括引物分子內中部序列ID干擾技術，采用將ID反義堿基序列連接于引物5’端前面使引物分子內3’端含特異性靶結...

【專利技術屬性】
技術研發人員：江洪，岳素文，廖同兵，江必勝，曲越，江雨康，
申請(專利權)人：北京泰格瑞分子檢驗有限公司，
類型：發明
國別省市：