用于生產能夠轉化阿拉伯糖的細胞的方法技術

本發明專利技術涉及用于生產能夠轉化阿拉伯糖的細胞的方法，其包含下述步驟：a)將基因AraA、araB和araD引入不能夠轉化阿拉伯糖的宿主菌株，該細胞被命名為構建細胞；b)使構建細胞進行適應性進化直到獲得轉化阿拉伯糖的細胞；c)任選地，使第一阿拉伯糖轉化細胞進行適應性進化，以改進阿拉伯糖轉化；在步驟b)或c)中生產的細胞被命名為第一阿拉伯糖轉化細胞；d)分析第一阿拉伯糖轉化細胞和構建細胞的全基因組或部分基因組；e)鑒定第一阿拉伯糖轉化細胞中的單核苷酸多態性(SNP)；和f)在能夠轉化阿拉伯糖的細胞的合理設計中使用SNP的信息；g)構建在步驟f)中設計的能夠轉化阿拉伯糖的細胞。

【技術實現步驟摘要】
【國外來華專利技術】
本專利技術涉及。本專利技術還涉及可通過所述方法生產的細胞。本專利技術進一步涉及其中使用這類細胞生產發酵產物例如乙醇的方法。
技術介紹
最近幾十年，傳統化石燃料(基于石油的燃料)的大規模消耗造成了高水平的污染。這與化石燃料的世界儲備并非有限的認識以及增長的環境意識一起刺激了研究替代性燃料(如乙醇)可行性的新動機，所述替代性燃料是以每升為基礎比無鉛汽油釋放更少CO2的無粒子燃燒燃料來源。盡管生物量衍生的乙醇可以通過得自許多不同來源的己糖的發酵來生產，但是，典型地用于商業規模生產燃料醇的底物如甘蔗和玉米淀粉是昂貴的。因此，燃料乙醇生產的提高會需要使用更低成本的原料。目前，只有衍生自植物生物量的木質纖維素原料能夠足量獲得，用于代替目前用于乙醇生產的作物。在大部分木質纖維素材料中，在C6糖之后的第 二常見的糖還包含相當大的量的C5糖(包括阿拉伯糖)。因此，對于經濟上可行的燃料生產工藝而言，己糖和戊糖均必須被發酵形成乙醇。酵母Saccharomycescerevisia是有活力的并且充分適合乙醇生產,但是不能夠轉化阿拉伯糖。另外，沒有一種天然存在的生物是已知能夠以高乙醇產量以及高乙醇生產力將木糖發酵成乙醇的。因此，對下述生物存在需要，所述生物具有這些特性從而能夠在商業上有活力地從木質纖維素原料生產乙醇。
技術實現思路
本專利技術的目的是提供能夠轉化阿拉伯糖的細胞，特別是酵母細胞。根據本專利技術達到了該目的，本專利技術提供了，所述方法包括下述步驟:a)將基因araA、araB和araD引入不能夠轉化阿拉伯糖的宿主菌株,該細胞被命名為構建細胞；b)使構建細胞進行適應性進化直到獲得轉化阿拉伯糖的細胞，c)任選地，使第一阿拉伯糖轉化細胞進行適應性進化，以改進阿拉伯糖轉化；步驟b)或c)中產生的細胞被命名為第一阿拉伯糖轉化細胞；d)分析第一阿拉伯糖轉化細胞和構建細胞的基因組的一部分或全基因組；e)鑒定第一阿拉伯糖轉化細胞中的單核苷酸多態性(SNP);并f)在能夠轉化阿拉伯糖的細胞的合理設計中使用SNP信息；g)構建在步驟f)中設計的能夠轉化阿拉伯糖的細胞。除了酵母細胞BIE201外，本專利技術還提供了具有基因araA、araB和araD的酵母細胞，其中染色體VII具有通過電泳測定的從1300至1600Kb的大小。本專利技術還涉及多肽，所述多肽屬于下述多肽組成的組:a.多肽，其具有由在SSYl中具有置換E455終止子的多核苷酸SEQ IDNO:14編碼的序列，以及其變體多肽，其中一個或多個其他位置具有用AA反式超家族中已有的氨基酸的另一種氨基酸對氨基酸的突變；b.多肽，其具有由在YJR154W中具有置換D171G的多核苷酸SEQ IDNO: 16編碼的序列，以及其變體多肽，其中一個或多個其他位置具有用PhyH超家族中已有的保守氨基酸的另一種氨基酸對氨基酸的突變；c.多肽，其具有由在CEP3中具有置換S396G的多核苷酸SEQ ID NO:18編碼的序列；d.多肽，其具有由在GAL80中具有置換T146P的SEQ ID NO:20編碼的序列；和其變體多肽，其中一個或多個其他位置可具有用NADB Rossmann超家族中已有的保守氨基酸的氨基酸對氨基酸的突變。附圖簡述附圖說明圖1展示了載體pPWT006的物理圖譜。圖2展示了質粒pPWT018的物理圖譜，其序列在SEQ ID NO:1中給出。圖3展示了顯示雜交實驗結果的放射自顯影圖，所述雜交實驗顯示了在CEN.PK113-7D中的質粒pPWT080的一個拷貝的正確整合；圖4展示了質粒pPWT080的物理圖譜，其序列在SEQ ID NO:8中給出。圖5展示了在作為唯一碳源的2%阿拉伯糖上的參照菌株BIE104A2P1的需氧生長曲線，圖6展示了在作為唯一碳源的2%阿拉伯糖上的BIE104A2P1C的厭氧生長曲線，圖7展示了 BIE104的生長曲線(0D600的糖_、乙醇-和甘油濃度)和產生的C02 (ml/hr，第二軸)，BIE104在2%葡萄糖上預培養并在具有5%葡萄糖、5%木糖、3.5%阿拉伯糖和I %半乳糖的Verduyn培養基中生長,所有％以w/w的形式。圖8展示了 BIE104A2P1C的生長曲線(0D600的糖_、乙醇-和甘油濃度)和產生的C02 (ml/hr，第二軸)，BIE104A2Plc在2%葡萄糖上預培養并在具有5%葡萄糖、5%木糖、3.5%阿拉伯糖和I %半乳糖的Verduyn培養基中生長。圖9展示了 BIE201的生長曲線(0D600的糖-、乙醇-和甘油濃度)和產生的C02 (ml/hr，第二軸)，其在2%葡萄糖上預培養并在具有5%葡萄糖、5%木糖、3.5%阿拉伯糖和I %半乳糖的Verduyn培養基中生長,所有％以w/w的形式。圖10展示了雜交的示意圖。圖11展示了“標準化熔融曲線”(熔融曲線；上圖)和“標準化熔融峰”曲線(下圖)的例子。后者源于第一圖并顯示作為溫度函數的熒光信號的變化。展示菌株BIE104A2P1和BIE201。在該圖中測試的基因是YJR154w。兩個測試的菌株BIE201和BIE104A2P1之間探針的熔融溫度的不同是清楚的。圖12展示了在菌株BIE201中染色體VII的示意圖(覆蓋圖)。讀取深度闡釋為沿著染色體的位置的函數。染色體VII的一些部分表示為多重拷貝，即2倍或3倍重復出現。圖13展示了用溴化乙錠染色的CHEF凝膠。按照它們的大小使用CHEF技術將染色體分開。分析的菌株是BIE104(未轉化的酵母細胞)、BIE104A2Pla(不能消耗阿拉伯糖的初次轉化體，BIE104A2P1的同 義詞)、通過適應性進化源自BIE104A2P1的菌株BIE104A2Plc，其能夠在阿拉伯糖上生長和通過適應性進化源自BIE104A2Plc的菌株BIE201，其在厭氧條件下可在阿拉伯糖上生長。觀察到染色體的轉變(見正文)。菌株YNN295是標記物菌株(Bio-Rad)。圖14展示了用araA探針印跡和雜交的CHEF凝膠。按照它們的大小使用CHEF技術將染色體分開。分析的菌株是BIE104(未轉化的酵母細胞)、BIE104A2Pla(不能消耗阿拉伯糖的初次轉化體，BIE104A2P1的同義詞)、BIE104A2Plc，通過適應性進化源自BIE104A2P1的菌株，其能夠在阿拉伯糖上生長和通過適應性進化源自BIE104A2P1C的菌株BIE201，其在厭氧條件下可在阿拉伯糖上生長。觀察到染色體的轉變(見正文)。菌株YNN295是標記物菌株(Bio-Rad)，用作染色體大小的參照。圖15展示了用ACTl探針印跡和雜交的CHEF凝膠。按照它們的大小使用CHEF技術將染色體分開。分析的菌株是BIE104(未轉化的酵母細胞)、BIE104A2Pla(不能消耗阿拉伯糖的初次轉化體，BIE104A2P1的同義詞)、BIE104A2Plc、通過適應性進化源自BIE104A2P1的菌株，其能夠在阿拉伯糖上生長和通過適應性進化源自BIE104A2P1C的菌株BIE201，其在厭氧條件下可在阿拉伯糖上生長。觀察到染色體的轉變(見正文)。菌株YNN295是標記物菌株(Bio-Rad)，用作染色體大小的參照。圖16展示了用PNCl探針印跡和雜交的CHEF凝膠。按照它們的大小使用CHEF技術將染色本文檔來自技高網...

【技術保護點】

【技術特征摘要】
【國外來華專利技術】...

【專利技術屬性】
技術研發人員：保羅·克萊斯森，比安卡·伊麗莎白·瑪麗亞·吉勒森，威爾伯特·赫爾曼·馬里·海涅，吉斯博蒂娜·皮特奈拉·蘇勒庫姆·范，
申請(專利權)人：帝斯曼知識產權資產管理有限公司，
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