一種新的制備TAT-Oct4的方法技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)涉及蛋白質(zhì)制備和鑒定方法，特別是涉及在巴斯德酵母中表達(dá)一種穿膜肽(TAT)與人Oct4的融合蛋白(TAT-Oct4)的方法。

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】

本專利技術(shù)涉及蛋白質(zhì)制備和鑒定方法，特別是涉及在巴斯德酵母中表達(dá)一種穿膜肽(TAT)與人0ct4的融合蛋白(TAT-0ct4)的方法。
技術(shù)介紹
0ct4是一種具有很強(qiáng)特異性的胚胎干細(xì)胞標(biāo)志物，而且在哺乳動(dòng)物胚胎發(fā)育過程中0ct4起著嚴(yán)密的不可替代的調(diào)控作用。人的0ct4基因長(zhǎng)度是16.40kb，位置在6號(hào)染色體上(6p21.31)。0ct4也稱為0ct3是由Pou5Fl基因編碼產(chǎn)生的一種蛋白，屬于V類POU蛋白，是一種POU轉(zhuǎn)錄因子。POU轉(zhuǎn)錄因子是一種DNA結(jié)合蛋白，其構(gòu)成主要包括POU保守結(jié)構(gòu)域(POUS)和POU同源異型結(jié)構(gòu)域(POUH)，由15 55個(gè)氨基酸序列中間連接。N端的POU家族特有保 守結(jié)構(gòu)域(POUs)大約由74 82個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成，C端的同源異型結(jié)構(gòu)域(POUH)大約60個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成。在POU保守結(jié)構(gòu)域(POUS)和POU同源異型結(jié)構(gòu)域(POUH)都有一個(gè)各有脯氨酸富集區(qū)域，這兩個(gè)脯氨酸的富集區(qū)域是0ct4因子的轉(zhuǎn)錄活性區(qū)。0ct4是維持細(xì)胞多能性的重要轉(zhuǎn)錄因子之一，其主要是通過調(diào)控自身下游靶基因而參與正常發(fā)育過程，在胚胎早期發(fā)育中起著極其關(guān)鍵的作用。有研究認(rèn)為0ct4基因與胚胎干細(xì)胞(ES)細(xì)胞分化密切相關(guān)，多能干細(xì)胞的數(shù)量受到0ct4控制。進(jìn)一步的研究還發(fā)現(xiàn)，當(dāng)ES細(xì)胞中0ct4基因的表達(dá)水平受到人為的調(diào)控可使ES細(xì)胞向不同方向分化。2006年日本科學(xué)家Takahashi和Yamanaka通過對(duì)多種轉(zhuǎn)錄因子的篩選,最后利用逆轉(zhuǎn)錄病毒將轉(zhuǎn)錄因子0ct4等4種轉(zhuǎn)錄因子基因轉(zhuǎn)入成纖維細(xì)胞，成功地將成纖維細(xì)胞重編程為誘導(dǎo)性多功能干細(xì)胞(iPS細(xì)胞)。隨著iPS技術(shù)的不斷發(fā)展，有研究證明通過轉(zhuǎn)錄因子0ct4單獨(dú)誘導(dǎo)重編程也成功得到iPS細(xì)胞，這進(jìn)一步證明了 0ct4在細(xì)胞重編程過程中起著極其關(guān)鍵的作用。然而，現(xiàn)有的方法幾乎都是利用逆轉(zhuǎn)錄病毒將轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞內(nèi)，由于引入外源DNA的引入容易引起宿主細(xì)胞突變，這一現(xiàn)象是當(dāng)前iPS技術(shù)發(fā)展中的一個(gè)重要難題。能夠通過耗能或非耗能形式穿過多種細(xì)胞膜的小分子多肽(其長(zhǎng)度一般不超過30個(gè)氨基酸)被命名為穿膜肽。1988年，Green等和Frankel等首次報(bào)道了 HIV-1的反式激活蛋白TAT具有主動(dòng)穿過多種細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部的作用。隨著不斷的深入研究，發(fā)現(xiàn)穿膜肽除了自身能透過多種細(xì)胞膜，還能攜帶比自身分子量大很多倍的寡聚核苷酸進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，而且對(duì)宿主細(xì)胞沒有明顯的毒副作用。穿膜肽已成為生物和醫(yī)學(xué)領(lǐng)研究域的一個(gè)新的熱點(diǎn)。我們?cè)O(shè)計(jì)的融合蛋白目的是替代現(xiàn)有的利用逆轉(zhuǎn)錄病毒侵染的方式來獲得誘導(dǎo)性多功能干細(xì)胞(iPS細(xì)胞)，利用穿膜肽TAT特有的生物學(xué)活性，使0ct4直接作用于宿主細(xì)胞，從根本上避免了利用逆轉(zhuǎn)錄病毒侵染的方式將外源基因?qū)胧荏w細(xì)胞帶來的突變等各種不良后果。巴斯德畢赤酵母是低等真核生物，于20世紀(jì)80年代初開發(fā)獲得。巴斯德畢赤酵母具有細(xì)胞生長(zhǎng)快，易于培養(yǎng)，遺傳操作簡(jiǎn)單等原核生物的特點(diǎn)，又具有真核生物時(shí)表達(dá)的蛋白質(zhì)進(jìn)行正確加工，修飾，合理的空間折疊等功能，非常有利于真核基因的表達(dá)，能有效克服原核表達(dá)系統(tǒng)缺乏蛋白翻澤后加工、修飾的不足。因此巴斯德畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)受到越來越多的重視和利用。巴斯德畢赤酵母系統(tǒng)的廣泛應(yīng)用，原因在于該系統(tǒng)主要有以下幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)；(I)具有乙醇氧化酶AOXl基因啟動(dòng)子，這是目前最強(qiáng)，調(diào)控機(jī)理最嚴(yán)格的啟動(dòng)子之一 O(2)表達(dá)質(zhì)粒能在基因組的特定位點(diǎn)以單拷貝或多拷貝的形式穩(wěn)定整合。(3)菌株易于進(jìn)行高密度發(fā)酵，外源蛋白表達(dá)量高。(4)巴斯德畢赤酵母中存在過氧化物酶體，表達(dá)的蛋白貯存其中，可免受蛋白酶的降解，而且減少對(duì)細(xì)胞的毒害作用。(5)營(yíng)養(yǎng)要求低,培養(yǎng)基成分簡(jiǎn)單,生產(chǎn)成本低,特別適用于工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)。(6)屬于單細(xì)胞生物，故保留了易于操作和生長(zhǎng)速度快的特點(diǎn)。(7)表達(dá)的蛋白質(zhì)既可存在于胞內(nèi)又可分泌至胞外，巴斯德畢赤酵母自身蛋白質(zhì)的分泌量很低，十分有利于目的產(chǎn)物純化。(8)作為真核表達(dá)系統(tǒng)，可對(duì)表達(dá)的蛋白進(jìn)行翻譯后的正確加工和修飾。甲基營(yíng)養(yǎng)酵母，特別是巴斯德畢赤酵母是已被深入研究的真核表達(dá)系統(tǒng)，并已被用于表達(dá)許多有用的蛋白質(zhì) 。例如，美國(guó)專利5，324，639公開了在甲基營(yíng)養(yǎng)酵母特別是巴斯德畢赤酵母細(xì)胞中生產(chǎn)胰島素樣生長(zhǎng)因子I的方法；美國(guó)專利5，330，901公開了使用巴斯德畢赤酵母系統(tǒng)表達(dá)人血清白蛋白的方法；美國(guó)專利5，965，389提供了在甲基營(yíng)養(yǎng)酵母中表達(dá)L-谷氨酸脫羧酶(GAD65)的DNA構(gòu)建體以及由之制備純的GAD65的方法；美國(guó)專利公開了在巴斯德畢赤酵母中表達(dá)血小板衍生的細(xì)胞因子(TOGF)的方法；美國(guó)專利6，780，615描述了使用重組巴斯德畢赤酵母生產(chǎn)應(yīng)樂果甜蛋白的方法。然而，迄今尚未見關(guān)于使用巴斯德畢赤酵母生產(chǎn)融合蛋白TAT-0ct4的報(bào)道。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
本專利技術(shù)涉及蛋白質(zhì)制備和鑒定方法，特別是涉及在巴斯德酵母中表達(dá)一種穿膜肽(TAT)與人0ct4的融合蛋白(TAT-0ct4)的方法。本專利技術(shù)的一個(gè)目的是提供一種集TAT與人0ct4的特性于一體的TAT_0ct4融合蛋白。本專利技術(shù)的TAT與人0ct4融合蛋白是包括與天然TAT序列相同區(qū)域和與0ct4序列相同的另一區(qū)域。在本專利技術(shù)的融合蛋白中，可以是與天然TAT同源的區(qū)域位于融合蛋白的N-端，與人0ct4同源的區(qū)域位于融合蛋白的C-端；也可以是與天然TAT同源的區(qū)域位于融合蛋白的C-端，與人0ct4同源的區(qū)域位于融合蛋白的N-端。 本專利技術(shù)的另一目的是提供編碼本專利技術(shù)融合蛋白的DNA序列。包括與天然TAT氨基酸殘基序列相同的區(qū)域和與人0ct4氨基酸殘基序列相同的區(qū)域構(gòu)成的融合蛋白的DNA序列。本專利技術(shù)的再一個(gè)目的是提供一種使用甲基營(yíng)養(yǎng)酵母生產(chǎn)融合蛋白TAT_0ct4多肽的方法，該方法包括在以甲醇為碳源和能源的培養(yǎng)基中培養(yǎng)甲基營(yíng)養(yǎng)酵母，其中所說的甲基營(yíng)養(yǎng)酵母是用包括下列可操作地連接的元件的DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的:(I)甲醇可誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子；(2)編碼TAT_0ct4的DNA片段；(3)轉(zhuǎn)錄終止子和(4)可選擇標(biāo)志，從而以至少120mg/L培養(yǎng)基的濃度產(chǎn)生TAT-0ct4多肽。根據(jù)本專利技術(shù)的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，其中所說的甲基營(yíng)養(yǎng)酵母是巴斯德畢赤酵母，并且所說的甲醇可誘導(dǎo)的啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)錄終止子均來自巴斯德畢赤酵母AOXl基因。本專利技術(shù)的又一個(gè)目的是提供用于表達(dá)融合蛋白TAT_0ct4的甲基營(yíng)養(yǎng)酵母，該酵母能夠依靠作為碳源和能源的甲醇生長(zhǎng)，并且是被包括甲醇可誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子、編碼TAT-0ct4的DNA片段、轉(zhuǎn)錄終止子和可選擇標(biāo)志的DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的。根據(jù)本專利技術(shù)的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，其中所說的甲基營(yíng)養(yǎng)酵母是巴斯德畢赤酵母，并且甲醇可誘導(dǎo)的啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)錄終止子均來自巴斯德畢赤酵母AOXl基因。本專利技術(shù)的再一個(gè)目的是提供用于在巴斯德畢赤酵母中TAT_0ct4多肽的DNA構(gòu)建體，該構(gòu)建體包括可操作地連接的元件:甲醇可誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子、編碼TAT-0ct4的DNA片段、轉(zhuǎn)錄終止子和可選擇標(biāo)志。根據(jù)本專利技術(shù)的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，其中所說的甲基營(yíng)養(yǎng)酵母是巴斯德畢赤酵母，并且所說的甲醇可誘導(dǎo)的啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)錄終止子均來自巴斯德畢赤酵母AOXl基因。巴斯德畢赤酵母自身分泌的蛋白非常少，而且培養(yǎng)基中不含有本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種集天然TAT與人Oct4的特性于一體的TAT?Oct4融合蛋白，其特征在于：所述融合蛋白包括與天然TAT氨基酸殘基序列相同的區(qū)域和與人Oct4氨基酸殘基序列相同的另一區(qū)域，或上述二區(qū)的功能同等物。

【技術(shù)特征摘要】
1.一種集天然TAT與人0ct4的特性于一體的TAT-0ct4融合蛋白，其特征在于:所述融合蛋白包括與天然TAT氨基酸殘基序列相同的區(qū)域和與人0ct4氨基酸殘基序列相同的另一區(qū)域，或上述二區(qū)的功能同等物。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的集TAT與野生型0ct4的特性于一體的TAT-0ct4融合蛋白，其特征在于:所述與天然TAT氨基酸殘基序列同源的區(qū)域位于融合蛋白的N-末端，所述與人0ct4氨基酸殘基序列同源的另一區(qū)域位于融合蛋白的C-末端。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的集TAT與0ct4的特性于一體的TAT-0ct4融合蛋白，其特征在于:所述與天然TTAT氨基酸殘基序列同源的區(qū)域位于融合蛋...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：顏煒群，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：吉林圣元科技有限責(zé)任公司，
類型：發(fā)明
國(guó)別省市：