一種鑒定外來入侵物種互花米草種群的DNA分子標記方法技術

本發明專利技術涉及一種鑒定外來入侵物種互花米草種群的DNA分子標記方法，本方法根據高通量轉錄組測序篩選得到目標基因，通過PCR反應、PCR產物測序得到多個單核苷酸多態性（SNP）位點。再由所有有效的單核苷酸多態性位點組成單倍體型用于分子標記以達到遺傳分型。本發明專利技術在一次實驗中，即可得到豐富的多態性信息。單核苷酸多態性標記遺傳穩定，可用于不同來源的樣本，適宜高通量自動化分析。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術屬于生態工程
，涉及一種鑒定外來入侵物種互花米草種群的DNA分子標記方法。
技術介紹
外來生物入侵已成為當今環境保護中最為迫切的問題之一，其對世界各國的經濟、生態、社會安全以及國際貿易都有著十分重要的影響。美國每年直接或間接用于入侵物種管理的費用就高達1370億美元。中國同樣也已成為全球遭受外來物種入侵危害最嚴重的國家之一，已發現外來入侵物種488種，其中50余種位列世界自然保護聯盟公布的全球100種最具威脅外來物種，每年造成的直接經濟損失達1200億元，治理投入更是難以估算。近年來入侵我國的外來生物更是呈現出傳入數量增多、傳入頻率加快、蔓延范圍擴大、發生危害加劇、經濟損失加重等趨勢。因此，生物入侵問題越來越受到世人的關注，包括其成因、危害及控制技術等諸多方面。但目前，大部分的研究主要集中在競爭性排斥、生態位替代、生物學特性、化感、捕食、寄生等生態過程，缺乏對其種群動態、快速適應與進化模式、快速入侵與擴張動力等入侵機制方面的理解。DNA分子標記(DNA molecular markers)本質上是指能反映生物個體或種群間基因組中某種差異特征的DNA片段，也即基因型在DNA水平上的表現形式。這種DNA片段是基因組DNA經限制性內切酶切割，或分子雜交后在電泳凝膠上檢測得到的。目前DNA分子標記技術主要包括三類:(I)以分子雜交為基礎的，如RFLP、VNTR等；(2)以PCR技術為基礎的，如RAPD、AFLP, DAF、STS、SSR、SCAR等；(3)利用DNA芯片、直接測序等方法檢測單核苷酸多態性(SNP)。單核苷酸多態性是指同一位點的不同等位基因之間僅有個別核苷酸的差異或只有小的插入、缺失等。從分子水平上對單個核苷酸的差異進行檢測，單核苷酸多態性標記可幫助區分個體間遺傳物質的差異。隨著分子標記技術的成熟及其在分子生態學中的廣泛應用，外來物種入侵機理日益成為國際上研究的重點。大量的研究表明外來入侵種能在如此短的時間內迅速地做出適應性的進化，可能與其自身的遺傳結構密切相關。因而，在外來入侵物種上，亟需一種能夠有效揭示外來入侵物種遺傳本質的方法。互花米草(Spartina alternif1ra)是一種原產北美大西洋沿岸的多年生草本植物。因其促淤造陸和消浪護堤作用顯著而被許多國家引種。1979年，南京大學從美國東南部的北卡羅萊納、喬治亞和佛羅里達引種了 3種不同生態型互花米草至福建羅源灣，隨后擴大分布至我國海岸潮間帶遼寧丹東以南的廣大區域，并取得了一定的生態和經濟效益。但作為外來物種，其強大的繁殖能力和高大密集的種群特征，對我國沿海灘涂地區的生態系統、生物多樣性和水產養殖產生了較大的負面影響，2003年被環保總局列入我國第一批16種外來入侵物種名單。因此，對其入侵過程和擴張機制的研究已刻不容緩。本專利技術以列入中國首批外來入侵物種的互花米草為對象，在整個基因組內批量尋找多態性位點，全面評估外來入侵物種的多樣性，并揭示其遺傳本質和入侵機制，為進一步研究和控制外來入侵物種提供有力的技術支持。
技術實現思路
本專利技術的目的是提供一種鑒定外來入侵物種互花米草的分子標記方法，能夠在基因組序列信息較少的情況下，獲得大量的核苷酸多態性標記，發現引入的不同種群之間存在的遺傳變異，為揭示其遺傳本質和入侵機制，進一步研究和控制外來入侵物種提供有力的技術支持。本專利技術的目的是通過以下技術方案實現的:一種鑒定外來入侵物種互花米草種群的DNA分子標記方法，步驟如下:1)種群調查及取樣；2) DNA 提取；3)測序;4)篩選目標基因R52;5)根據目標基因R52設計引物，正向引物如序列表中SEQ ID NO:1所示；反向引物如序列表中SEQ ID NO:2所示；6) PCR 擴增；7)測序；8)序列拼接、比對，鑒定記錄單核苷酸多態性位點。進一步地，所述目標基因R52是通過高通量轉錄組測序后篩選得到。進一步地，所述PCR擴增的反應條件為:94°C預變性3min，94°C 30s、54°C 30s、72°C 1.5min,37 個循環，72°C延伸 10min.進一步地，所述目標基因R52在互花米草種群中有8個SNP位點，目標基因R52基因片段序列如序列表中SEQ ID NO:3所示，其中8個SNP位點分別位于118、212、251、305、578、869、934、962。進一步地,高通量轉錄組測序的方法:提取樣本總RNA,用Oligo (dT)的磁珠富集分離mRNA,合成雙鏈cDNA,構建轉錄組測序文庫,插入片段長度約為500bp,在illuminaHiSeq2000測序儀上進行高通量測序，使用Trinity軟件對測序片段進行拼接，從而得到基因序列。本專利技術的有益效果:包括互花米草在內的許多外來入侵物種為非模式植物，基因組龐大，很多物種缺少全基因組數據，在進行傳統的各種傳統分子標記分析時，如RAPD、SSR、AFLP，發現實驗結果的一致性較差，假陽性率偏高。而且，傳統分子標記一次實驗只能找到少量多態性位點信息，如果需要高精度的分辨率，需要多次實驗。本專利技術在一次實驗中，即可得到8個單核苷酸多態性SNP位點，提供豐富的多態性信息。同時，本專利技術的實驗條件簡單，成功率高，可重復性好。在實施過程中，實驗成功率在98%以上，實驗結果可重復性更達到100%。本專利技術采用的8個SNP位點，單倍體基因型理論上可以達到2的8次方，即256，能夠提供非常豐富的多態性信息，使結果更加準確。SNP標記遺傳穩定，可用于不同來源的樣本，適宜高通量自動化分析。具體實施方式:下面結合具體樣本對本專利技術做進一步的詳細說明，所述是對本專利技術的解釋而不是限定。1.種群調查及取樣最早引入外來入侵物種的地區，福建羅源灣的互花米草是我國的最原始種群，將其作為采樣點。上海崇明島距離分析點較近，采集后樣品保存度高，將其作為采樣點。選取生長良好、無蟲害的葉片，采下后立刻放入事先準備好的裝有約半袋硅膠的自封袋里，混勻使葉片與硅膠充分混合，以便快速脫水。帶回實驗室后根據實際情況更換已經變色的硅膠，干燥之后待提取DNA用。每一采樣點隨機取樣30株左右，個體間的間距不小于50米，以盡可能避免重復采集同一克隆，記錄每一樣本的編號、生境、地理參數(經緯度)、樣品高度，樣品直徑等詳細信息。2.DNA 提取使用BioFlux公司的Biospin植物基因組DNA提取試劑盒進行DNA提取，具體步驟稍作調整:(I)稱取0.07-0.1g干葉，用剪刀剪碎；用液氮冷凍研缽、研棒，將材料倒入盛有液氮的研缽中，用力磨成粉末，在研磨過程中注意不要讓材料反復凍融。(2)將研磨好的粉末用勺小心地轉移至預先加入450uL LP Buffer的2.0ml離心管中，混合均勻。(3)65°C金屬浴中溫浴30-60分鐘(溫浴過程中間隔振蕩2_3次)，然后移出。(4)加入150uL DA Buffer，混合均勻后于冰浴中放置5分鐘。(5)于13，OO Orpm離心10分鐘，再將上清液轉移至Shredder spin column中,13, OOOrpm離心I分鐘。(6)將濾液轉移到一個新的1.5ml離心管中。(7)加入濾液體積1.5倍的P Binding Buffer,輕柔的混合均勻，管中出現絮狀沉淀，13, OOOrpm離心本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種鑒定外來入侵物種互花米草種群的DNA分子標記方法，其特征在于，步驟如下：1)種群調查及取樣；2)DNA提取；3)測序；4)篩選種群的目標基因R52；5)根據目標基因R52設計引物，正向引物如序列表中SEQ?ID?NO：1所示；反向引物如序列表中SEQ?ID?NO：2所示；6)PCR擴增；7)測序；8)序列拼接、比對，鑒定記錄單核苷酸多態性位點。

【技術特征摘要】

【專利技術屬性】
技術研發人員：陳建群，許穎，王強，丁靜，吳娟子，
申請(專利權)人：南京大學，
類型：發明
國別省市：