本發(fā)明專利技術(shù)涉及，例如，α-取代的β-氨基酸酯衍生物不對稱水解酶，所述酶包括以下(a)或(b)的酶：(a)包含SEQ?ID?NO：1的至少第1位至第362位的氨基酸序列的酶，其中SEQ?ID?NO：1的第277位的酪氨酸被丙氨酸、色氨酸、異亮氨酸或組氨酸取代，并且所述酶具有水解底物的能力；或者(b)包含SEQ?ID?NO：1的至少第1位至第362位的氨基酸序列的酶，其中SEQ?ID?NO：1的第277位的酪氨酸被不同于酪氨酸的氨基酸取代，并且所述酶具有水解底物的能力。
【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)涉及適用于α-取代的氨基酸酯衍生物的不對稱水解的酶，編碼所述酶的多核苷酸等。
技術(shù)介紹
旋光α -取代的β -氨基酸衍生物作為用于制備藥物本體(bulk)化合物、農(nóng)業(yè)化學(xué)品或生物活性物質(zhì)的原料和中間體是有用的。例如，專利文獻(xiàn)I公開了被用作用于制備抗菌劑的物質(zhì)的旋光α-取代的β_氨基酸衍生物。此外，非專利文獻(xiàn)I和2公開了被用作用于制備細(xì)胞毒性酯肽念珠草環(huán)肽(cryptophycin)的中間體的旋光α-取代的β-氨基酸衍生物。水解酶具有水解底物的能力，并且近年來，已被用于制備例如用作藥物或農(nóng)業(yè)化學(xué)品的活性成分的化合物或其中間體的有機(jī)合成反應(yīng)。尤其，水解酶已被用于制備旋光化合物或其中間體的有機(jī)合成反應(yīng)。例如，具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列并且具有水解底物的能力的酶已知作為水解酶(參見例如，專利文獻(xiàn)2)。理想的是，這樣的用于制備旋光化合物或其中間體等的可用于工業(yè)的水解酶，具有以下性質(zhì):產(chǎn)生具有高光學(xué)純度的水解反應(yīng)產(chǎn)物的能力；高度識別底物的絕對構(gòu)型的能力；對各種反應(yīng)條件如溫度，ΡΗ，溶劑或壓力的高度穩(wěn)定性；等等。尤其，如果反應(yīng)產(chǎn)物具有高光學(xué)純度(即水解酶的光學(xué)選擇性高)，則在酶反應(yīng)后不需要純化步驟以致于旋光化合物可以以有利的產(chǎn)率被合成。引用列表專利文獻(xiàn)專利文獻(xiàn)1:W0 02/102790專利文獻(xiàn)2:日本專利號3875283非專利文獻(xiàn)非專利文獻(xiàn)I J.Am.Chem.Soc.1995，117，2479非專利文獻(xiàn)2 :J.Chem.Soc.，Perkin Trans.1,2000,1461
技術(shù)實現(xiàn)思路
為了減少反應(yīng)步驟并提高生產(chǎn)率，強烈需要開發(fā)具有高光學(xué)選擇性的水解酶。本專利技術(shù)提供，例如，具有優(yōu)異光學(xué)選擇性的水解酶以及編碼所述酶的多核苷酸。在示例性實施方案中，本專利技術(shù)提供以下1)-8):I)以下(a)或(b)的酶(下文中，有時被稱為本專利技術(shù)的酶):(a)包含SEQ ID NO:1的至少第I位至第362位的氨基酸序列的酶，其中SEQ IDNO:1的第277位的酪氨酸被丙氨酸、色氨酸、異亮氨酸或組氨酸取代，并且所述酶具有水解底物的能力；或者(b)包含SEQ ID NO:1的至少第I位至第362位的氨基酸序列的酶，其中SEQ IDNO:1的第277位的酪氨酸被不同于酪氨酸的氨基酸取代，并且所述酶具有水解底物的能力；2)包含編碼根據(jù)I)的酶的氨基酸序列的核苷酸序列的多核苷酸(下文中，有時被稱為本專利技術(shù)的多核苷酸)；3)包含根據(jù)2)的多核苷酸的載體(下文中，有時被稱為本專利技術(shù)的載體)；4)引入有根據(jù)2)的多核苷酸的轉(zhuǎn)化體(下文中，有時被稱為本專利技術(shù)的轉(zhuǎn)化體)；5)包含根據(jù)3)的載體的轉(zhuǎn)化體；6) 一種生產(chǎn)酶的方法，所述方法包括培養(yǎng)根據(jù)4)或5)的轉(zhuǎn)化體；7) —種修飾包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的酶的方法，所述方法包括以下步驟:將SEQ ID NO:1的氨基酸序列中的第277位的酪氨酸用丙氨酸、色氨酸、異亮氨酸或組氨酸取代(下文中，有時被稱為本專利技術(shù)的酶修飾方法)；以及8) —種修飾包含編碼SEQ ID NO:1的氨基酸序列的核苷酸序列的多核苷酸的方法，所述方法包括以下步驟:將編碼SEQ ID NO:1的氨基酸序列的核苷酸序列中第829至831位的編碼酪氨酸的密碼子用編碼丙氨酸、色氨酸、異亮氨酸或組氨酸的密碼子取代(下文中，有時被稱為本專利技術(shù)的多核苷酸修飾方法)。根據(jù)本專利技術(shù)，可以提供具有優(yōu)異光學(xué)選擇性等的水解酶，所述水解酶可用于制備旋光化合物或所述旋光化合物的中間體、如旋光α-取代的氨基酸衍生物的有機(jī)合成反應(yīng)，所述旋光化合物可用作藥物或農(nóng)業(yè)化學(xué)品中的活性成分。具體實施方式下文中，更具體地說明本專利技術(shù)。當(dāng)在本文中使用時，本專利技術(shù)的酶可以被描述為SEQ ID NO:1的氨基酸序列中的位置號與表示氨基酸的字母表的一個字母的組合。例如，2771表示這樣的酶，所述酶包含相當(dāng)于SEQ ID NO:1的氨基酸序列的氨基酸序列，不同之處在于它具有氨基酸突變，其中SEQ ID NO:1的第277位的酪氨酸被異亮氨酸取代。關(guān)于本專利技術(shù)的酶，水解底物的能力(下文中，有時被稱為水解酶活性)可以例如通過以下方法確定:在水的存在下將所述酶與其底物如α-取代的β_氨基酸酯衍生物(具體地，例如，2-正丁基-3_[(Ν-芐氧基-N-甲酰基)氨基]丙酸乙酯)混合，隨后將該混合物在25°C孵育，并且然后通過高效液相色譜定量α-取代的β_氨基酸衍生物(具體地，例如，2-正丁基-3-[(N-芐氧基-N-甲?；?氨基]丙酸)在獲得的反應(yīng)溶液中的光學(xué)純度和化學(xué)純度。本專利技術(shù)的酶是通過以下(a)或(b)表征的酶:(a)包含SEQ ID NO:1的至少第I位至第362位的氨基酸序列的酶，其中SEQ IDNO:1的第277位的酪氨酸被丙氨酸、色氨酸、異亮氨酸或組氨酸取代，并且所述酶具有水解底物的能力；或者(b)包含SEQ ID NO:1的至少第I位至第362位的氨基酸序列的酶，其中SEQ IDNO:1的第277位的酪氨酸被不同于酪氨酸的氨基酸取代，并且所述酶具有水解底物的能力。具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的酶(下文中被稱為野生型水解酶)是本領(lǐng)域中已知的來源于色桿菌(Chromobacterium) SC-YM-1菌株(FERMBP-6703)的水解酶。當(dāng)在重組大腸桿菌(E.coli)中生產(chǎn)該野生型水解酶時，除了全長水解酶以外，還產(chǎn)生缺少全長水解酶的八個C端氨基酸的截短的水解酶。該截短的水解酶具有水解活性，并且其C端氨基酸是Glu，對應(yīng)于SEQ ID NO:1的氨基酸序列中的第362位的Glu。因此，本專利技術(shù)的酶可以具有對應(yīng)于SEQ ID NO:1的氨基酸序列的至少第I位至第362位的氨基酸序列。上述不同于酪氨酸的氨基酸是指構(gòu)成蛋白質(zhì)的20種氨基酸中除酪氨酸之外的任何氨基酸，包括甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、賴氨酸、精氨酸、組氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸或色氨酸。優(yōu)選地，上述不同于酪氨酸的氨基酸是指丙氨酸、色氨酸、異亮氨酸或組氨酸。本專利技術(shù)的酶的具體實例包括以下酶:基本上由SEQ ID NO:1的第I位至第362位的氨基酸序列組成的酶，其中SEQ IDNO:1的第277位的酪氨酸被丙氨酸取代，并且所述酶具有水解底物的能力；包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的酶，其中SEQ ID NO:1的第277位的酪氨酸被丙氨酸取代，并且所述酶具有水解底物的能力；基本上由SEQ ID NO:1的第I位至第362位的氨基酸序列組成的酶，其中SEQ IDNO:1的第277位的酪氨酸被色氨酸取代，并且所述酶具有水解底物的能力；包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的酶，其中SEQ ID NO:1的第277位的酪氨酸被色氨酸取代，并且所述酶具有水解底物的能力；基本上由SEQ ID NO:1的第I位至第362位的氨基酸序列組成的酶，其中SEQ IDNO:1的第277位的酪氨酸被異亮氨酸取代，并且所述酶具有水解底物的能力；包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的酶，其中SEQ ID NO:1的第277位的酪氨酸被異亮氨酸取代，并且所述酶具有水解底物的能力；基本上由SEQ ID NO:1的第I位至第36本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護(hù)點】
以下(a)或(b)的酶：(a)包含SEQ?ID?NO：1的至少第1位至第362位的氨基酸序列的酶，其中SEQ?ID?NO：1的第277位的酪氨酸被丙氨酸、色氨酸、異亮氨酸或組氨酸取代，并且所述酶具有水解底物的能力；或者(b)包含SEQ?ID?NO：1的至少第1位至第362位的氨基酸序列的酶，其中SEQ?ID?NO：1的第277位的酪氨酸被不同于酪氨酸的氨基酸取代，并且所述酶具有水解底物的能力。
【技術(shù)特征摘要】
2011.12.19 JP 2011-2771931.以下(a)或(b)的酶: (a)包含SEQID NO:1的至少第I位至第362位的氨基酸序列的酶，其中SEQ ID NO:1的第277位的酪氨酸被丙氨酸、色氨酸、異亮氨酸或組氨酸取代，并且所述酶具有水解底物的能力；或者 (b)包含SEQID NO:1的至少第I位至第362位的氨基酸序列的酶，其中SEQ ID NO:I的第277位的酪氨酸被不同于酪氨酸的氨基酸取代，并且所述酶具有水解底物的能力。2.一種多核苷酸，所述多核苷酸包含編碼根據(jù)權(quán)利要求1所述的酶的氨基酸序列的核苷酸序列。3.一種載體,所述載體包含根據(jù)權(quán)利要求2所述...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：秋山敏彥，平田紀(jì)彥，寶來真志，
申請(專利權(quán))人：住友化學(xué)株式會社，
類型：發(fā)明
國別省市：
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