一種牛泡沫病毒感染性克隆的構建及其應用制造技術

本發明專利技術一種牛泡沫病毒感染性克隆的構建及其應用，將在中國分離到的牛泡沫病毒3026(BFV3026)的原病毒基因組cDNA構建成感染性克隆pBFV。分類命名：大腸埃希氏菌Escherichia?coli，保藏日期：2011年6月29日，保藏單位：中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址：北京市朝陽區北辰西路1號院3號，保藏編號：CGMCC?No.4994。用該感染性克隆可模擬牛泡沫病毒3026感染生活周期的特點，經過轉染可產生有活性的牛泡沫病毒，為進一步研究其與宿主細胞間的相互作用奠定基礎。另外，可在構建牛泡沫病毒基因載體的過程中發揮作用。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術的技術方案涉及牛泡沫病毒感染性克隆的構建及其應用。
技術介紹
泡沫病毒(Foamy virus, FVs)是一種特殊的反轉錄病毒,始發現于1954年，由于它不表現任何病害，甚至難以將它同任何疾病聯系起來，所以對于它的研究遠遠滯后于其它反轉錄病毒，直到近幾年，隨著基因治療的發展，FVs的非致病性以及獨特的基因表達調控機制賦予其無與倫比的優勢用于轉移載體的構建，使其研究得以迅速發展。泡沫病毒(Foamy virus, FV)因在體外組織培養過程中可誘使敏感細胞發生內質網腫脹及空泡形成，出現類似泡沫樣病變，因而得名。然而，相對泡沫病毒在細胞水平上可引起嚴重病變，甚至導致細胞崩解，人們迄今尚未發現其引起任何疾病。目前，人類對泡沫病毒的認識還遠不足以勾勒出一張完整的圖譜，但其人畜共感染的特性，讓我們意識到絕不能忽視它的存在。近二十年的研究結果表明，這是一類非常特殊而又古老病毒。此外，隨著研究的深入也讓我們看到了其誘人的應用前景。·上個世紀初期人們就發現了反轉錄病毒，但并沒引起人類的足夠注意。直至上個世紀八十年代，隨著高致病性的人T細胞白血病病毒(human T-cell leukaemia virus,HTLV)和人免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus,HIV)的出現，反轉錄病毒才引起人們足夠的重視，對這類病毒的研究也得以逐漸深入。所有反轉錄病毒所共有的重要特征是:有著相似的基因組結構，病毒在復制周期中以基因組RNA為模板，利用反轉錄酶合成一條DNA拷貝，再以該拷貝為模板合成線狀雙鏈DNA，整合入宿主基因組，才能開始病毒基因的表達，完成病毒基因組的復制，釋放出成熟的病毒顆粒。泡沫病毒是一種復雜反轉錄病毒。基因組為二聚線型單鏈RNA，長約ll_12kb。在反轉錄病毒家族中居于首位。其基因組結構與典型的反轉錄病毒基本相同，其復制過程也需要進行反轉錄，隨后反轉錄出來的基因組DNA也必須整合至宿主基因組中，才能完成其生活周期。但由于泡沫病毒擁有著不同于其他反轉錄病毒的基因組成分、生活周期以及基因表達調控方式等，因此2002年國際病毒分類學委員會(ICTV)修改了反轉錄病毒科的命名規則。將原先該科中的七個屬中的六個歸到正反轉錄病毒亞科(Orthoretrovirinae)中，將泡沫病毒單獨歸為泡沫病毒亞科(Spumaretrovirinae)FVs廣泛分布于多種脊椎動物中，已經在人、牛、貓、馬、海獅以及所有其它非人靈長類動物如大猩猩、黑猩猩、狒狒、非洲綠猴中發現FVs的存在。實驗室馴化的靈長類FVs可以感染從人到魚幾乎所有的脊椎動物細胞利用體外表達的FVs Env重組蛋白可與多種細胞特異結合，FVs抗血清雖可中和這種結合，但不能抑制FVs的感染，表明FVs可能利用多種低親合力的受體完成侵入過程。泡沫病毒的體外復制無明顯的物種或組織特異性，可在多種細胞中完成其生活周期，并導致感染細胞發生強烈病變，形成合胞體，產生大量病毒，最后迅速死亡。但在體內卻不引發任何病癥,僅建立持續性感染并伴隨宿主終身。其中外周血淋巴細胞可能是它主要的復制場所之一，除B細胞、T細胞、單核及巨噬細胞外，不同來源的上皮細胞和成纖維細胞中也可檢測到FV的存在。對于人泡沫病毒(Human Foamy Virus, HFV)的大規模分子流行病學調查顯示:HFV雖可感染人體，但不會在人群中傳播，人類不是FV的天然宿主。雖然第一株FV是1971年分離自一位非洲鼻咽癌患者細胞培養物，但基因多態性分析顯示該病毒為猴泡沫病毒(Simian Foamy Virus，SFV)，推測由黑猩猩傳染給人，應命名為SFV_hu，表示其為分離自人源細胞的猴泡沫病毒。泡沫病毒在天然宿主中的傳播途徑為咬或舔，人感染FVs可能由于實驗室污染或動物咬傷所致。泡沫病毒的非致病原因尚不明確，推測可能與其在體內的復制水平低有關。對自然感染FV的猴子研究發現，泡沫病毒除能在口腔粘膜和唾液腺中的某些細胞中維持較高轉錄水平外，在其他細胞包括血液細胞中的轉錄水平均不高，并有大量復制缺陷型病毒顆粒產生。同時，病毒產生的Bet蛋白亦可能抵御病毒對宿主細胞的感染和裂解，對HFV的研究表明，其合成的Bet蛋白可分泌至胞外并被鄰近細胞所攝取且由此獲得對HFV的抗性。另夕卜，宿主的免疫反應也可能在抑制病毒復制方面發揮重要作用。被泡沫病毒感染的動物能產生高效價的抗體，包括Gag和Bet抗體以及中和抗體，并在抗體陽性個體的某些組織(包括口腔粘膜)中觀察到泡沫病毒基因的沉寂。目前對FV誘發的細胞和體液免疫應答尚缺乏足夠了解，也許這恰是解答FVs非致病性的關鍵所在。雖然有關泡沫病毒的研究尚存在許多未知領域，但對其復制特性、基因表達調控及病毒與宿主細胞相互關系的初步研究顯示，利用泡沫病毒構建的基因轉移載體有其獨特的優勢:首先，它可實現對不同種類、不同類型細胞系的轉移。以HFV為骨架構建的載體能以整合方式將新霉素磷酸轉移酶和堿性磷酸酶等基因導入脊椎動物細胞，如人包皮成纖維細胞、293T細胞、C0S-7細胞、非洲綠猴腎細胞、MDBK細胞、Cf2Th (狗胸腺)細胞、綿羊脈絡膜叢細胞及鼠、倉鼠和雞來源的多種細胞。與其它反轉錄病毒載體相比，泡沫病毒載體對休眠細胞及體內細胞具有更高的轉導效率。其次，對于人類非常安全。泡沫病毒在體內不表現任何病癥，迄今在自然感染及實驗感染的動物中未發現任何疾病與之對應。尤其對于人類，泡沫病毒不會在其間造成任何傳播，使泡沫病毒載體具有極高的安全性。同時，泡沫病毒的各種蛋白皆由獨立的mRNA編碼，并可通過異源啟動子啟動表達，而無需病毒其它順式元件調控，因而可將它們分別克隆于不同表達載體，以反式形式提供包裝，可降低載體與輔助質粒間的同源重組。也可用組成型啟動子替換轉移載體5’LTR中U3區，通過轉染僅表達病毒結構蛋白的包裝細胞系收集重組病毒，可完全排除復制型病毒顆粒的產生。此外，可以轉移大片段的DNA。泡沫病毒的基因組長度在反轉錄病毒家族中居于首位，由其構建的轉移載體具有較其它反轉錄病毒載體更大的外容量。也可使目的基因獲得穩定表達，泡沫病毒載體可使目的基因有效整合于宿主染色體上，并獲得迅速表達，不會出現外源基因的沉寂與丟失。同時，易獲得高滴度重組病毒。泡沫病毒成熟后，多滯留于細胞內，可通過反復凍融獲得高滴度的病毒儲液，即使進一步濃縮，也不會喪失感染性。并且不會被人血清滅活，因為多數人體內不存在FV抗體。構建感染性克隆，只是開始，還需要進一步的研究泡沫病毒自身的一些性質，與宿主間的相互作用等內容，充分開發泡沫病毒的應用價值。
技術實現思路
本專利技術所要解決的技術問題是:構建帶有BFV cDNA全長的感染性克隆。將本實驗分離的牛泡沫病毒BFV3026毒株的cDNA全長構建到可復制的質粒中，構建具有感染性的克隆，可經轉染產生野生型的病毒顆粒，也可在質粒水平經分子克隆手段將病毒cDNA進行改造，構建缺失或重組病毒，在研究泡沫病毒分子調節機制、與宿主的相互作用等方面具有很大的應用，同時也為構建病毒載體奠定基礎。本專利技術解決該技術問題所采用的技術方案是:一種牛泡沫病毒毒株，分類命名:大腸埃希氏菌Escherichia coli,保藏日期:2011年6月29日，保藏單位:中國微本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種牛泡沫病毒感染性克隆，其特征在于：將在中國分離到的牛泡沫病毒3026(BFV3026)的原病毒基因組cDNA構建成感染性克隆pBFV。分類命名：大腸埃希氏菌Escherichia?coli，保藏日期：2011年6月29日，保藏單位：中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址：北京市朝陽區北辰西路1號院3號，保藏編號：CGMCC?No.4994。

【技術特征摘要】
1.一種牛泡沫病毒感染性克隆，其特征在于:將在中國分離到的牛泡沫病毒3026 (BFV3026)的原病毒基因組cDNA構建成感染性克隆pBFV。分類命名:大腸埃希氏菌Escherichia coli,保藏日期:2011年6月29日，保藏單位:中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址:北京市朝陽區北辰西路I號院3號，保藏編號=CGMCC N0.4994。2.權利要求1所述一種牛泡沫病毒感染性克隆的構建及其應用，其特征在于:將該感染性克隆PBFV模擬牛泡沫病毒3026感染生活周期的特點。3.根據權利要求2所述的權利要求1所述一種牛泡沫病毒感染性...

【專利技術屬性】
技術研發人員：談娟，喬文濤，耿運琪，邴鐵軍，
申請(專利權)人：天津市國際生物醫藥聯合研究院，南開大學生命科學學院，
類型：發明
國別省市：