調節細胞微絲動態新機制的發現制造技術

神經細胞是一種由軸突，樹突和細胞體構成的重要極性細胞。軸突的形成是神經細胞分化形成的形態指標。細胞骨架的動態變化是軸突形成所必須的。由肌動蛋白聚合而成的微絲是重要的細胞骨架之一，其動態變化的分子機理還不清楚。本研究首次發現，從秀麗線蟲到哺乳動物具有保守性的UNC-51蛋白激酶既能結合又能磷酸化肌動蛋白，而且能使微絲形成顆粒狀分布并輸送顆粒狀微絲到細胞質基質中去；UNC-51蛋白激酶還能把N1E115神經瘤細胞誘導變成分叉神經狀細胞；無激酶活性的UNC-51突變體(K39M)蛋白則與微絲一起在細胞核周圍形成積聚體構造物，不能誘導N1E115細胞成為分叉神經狀細胞。根據以上發現結果，提出以下模型：UNC-51蛋白激酶通過直接地磷酸化肌動蛋白和輸送顆粒狀微絲到細胞質基質中的分子機理來調節細胞骨架的動態變化，進而調節神經細胞軸突的形成和功能。

【技術實現步驟摘要】

:本專利技術屬于基礎生命科學，生物化學，細胞生物學，分子生物學，腦科學，肌肉科學，神經細胞骨架學和神經細胞信號轉導學等多個領域，創新性地揭示了細胞微絲動態變化的新機理和神經細胞形成及工作的最新原理。
技術介紹
:細胞微絲的動態和神經細胞軸突及肌肉細胞的形成和功能，細胞分裂以及細胞運動等有密切的關系。通常認為，細胞內微絲的形成和功能間接地被微絲結合蛋白(成核蛋白Arp2/3復合物,絲切蛋白cofilin等)的磷酸化影響,但微絲動態的基本機理仍然不清楚。還沒有關于既直接磷酸化肌動蛋白也以其磷酸化機理影響微絲動態的激酶的報道。模式生物秀麗線蟲和哺乳動物的神經系統在形態學和生物化學上是相似的；一個保存性基因在秀麗線蟲和哺乳動物的不同實驗系里能表達相同的功效。秀麗線蟲的unc-51基因編碼一個從線蟲到人類的進化上具有保存性的絲/蘇氨酸蛋白激酶，是神經形成所必須的；這個基因的突變引起線蟲的神經形成及運動的欠缺和短粗體形。揭示unc-51基因所編碼的蛋白激酶的底物和其生物化學功能的意義是重要的
技術實現思路
: 本專利技術的目的在于揭示unc-51基因所編碼的蛋白激酶的重要底物和其生物化學功能，弄清楚神經細胞形成的分子機理，為神經和肌肉疾病的治療提供嶄新的原理和方法。本專利技術的內容為:(I)首次揭示肌動蛋白既能和UNC-51激酶結合，更能作為此激酶的底物被磷酸化肌動蛋白和UNC-51激酶的結合如圖1，圖2和圖5所示。圖1是把表達UNC-51激酶蛋白的人胚腎HEKs293細胞的溶胞產物用于免疫印跡后的結果，這圖顯示在被轉染的HEKs293細胞內，UNC-51激酶蛋白結合著肌動蛋白。圖2的體外酶聯免疫吸附測定結果顯示，來自秀麗線蟲及兔肌的肌動蛋白都能夠結合UNC-51激酶蛋白。圖5是激光掃描熒光共焦顯微鏡的圖像，這圖像顯示在非州綠猴腎細胞(C0S-7)質基質中，帶紅色熒光的顆粒狀UNC-51蛋白激酶和帶綠色螢光的顆粒狀肌動蛋白結合產生了顆粒狀的黃色熒光。圖3顯示UNC-51激酶在體外能夠磷酸化來自兔肌的肌動蛋白并自我磷酸化，ATP和GTP均可作為磷酸供體。圖4顯示秀麗線蟲和兔肌的肌動蛋白的絲氨酸被UNC-51激酶磷酸化。(2)首次揭示UNC-51蛋白激酶活性能輸送顆粒狀微絲到細胞質基質中去和圖6中無激酶活性的UNC-51突變蛋白(K39M)在細胞核周圍形成的積聚體相t匕，圖5顯示，過量表達UNC-51激酶蛋白(紅色)的C0S-7細胞中，UNC-51激酶活性能輸送粒狀肌動蛋白到細胞質基質中去。(3)首次揭示UNC-51蛋白激酶活性能夠誘導成神經細胞瘤NlEl 15細胞變成多分枝的神經性細胞圖7顯示，UNC-51激酶活性能誘導成神經細胞瘤N1E115細胞成為分叉神經似的細胞。圖8表示UNC-51激酶活性通過對細胞內肌動蛋白的磷酸化和運送顆粒狀肌動蛋白到細胞質基質中，誘導神經軸突形成的模型。附圖說明:圖1肌動蛋白和UNC-51激酶的體內結合圖2肌動蛋白和UNC-51激酶的體外結合圖3UNC-51激酶在體外磷酸化肌動蛋白并自我磷酸化圖4UNC-51激酶在體外磷酸化秀麗線蟲和兔肌的肌動蛋白的絲氨酸圖5UNC-51激酶活性能輸送粒狀肌動蛋白到細胞質基質中去圖6無激酶活性的UNC-51突變蛋白(K39M)和肌動蛋白在細胞核周圍形成積聚體圖7UNC-51激酶活性能誘導成神經細胞瘤NlEl 15細胞成為分叉神經似的細胞圖8UNC-51激酶活性通過對細胞內肌動蛋白的磷酸化和輸送粒狀肌動蛋白誘導神經軸突形成的模型具體實施方式:1UNC_51蛋白激酶和肌動蛋白結合的測定用細胞溶解 緩沖液溶解表達UNC-51蛋白激酶的HEK293細胞，得到的溶胞產物的上清用于免疫印跡。利用親和層析法從以上溶胞產物的上清純化得到UNC-51蛋白激酶。運用固相酶聯免疫測定法(ELISA)分析肌動蛋白和UNC-51蛋白激酶的體外結合。2激酶活性的測定在含有50μΜ末端放射性表記的腺苷三磷酸[Υ-32Ρ]-ΑΤΡ或者鳥苷三磷酸[Y -32Pl-GTP的Ifepes激酶緩沖反應液(pH7.4)中，進行了 UNC-51蛋白激酶磷酸化肌動蛋白的反應。用6.5%的SDS-PAGE和X-線膠片放射自顯影法分析測定了激酶活性。薄層纖維素板(TLC)上的雙向分離電泳法用于磷酸化絲氨酸的同定。3激光掃描熒光共焦顯微鏡的觀察DAPI用于細胞核染色，TexasRed和FITC分別用于UNC-51和肌動蛋白的染色。ZeiSSLSM510共焦顯微鏡被用于細胞觀察和記錄。本文檔來自技高網...

【技術保護點】
在試管內的生化實驗中，UNC?51的激酶活性直接地磷酸化非肌肉細胞肌動蛋白，肌肉細胞肌動蛋白和秀麗線蟲肌動蛋白，在試管內和在活體內的生化實驗中，UNC?51結合非肌肉細胞肌動蛋白，肌肉細胞肌動蛋白或秀麗線蟲肌動蛋白。

【技術特征摘要】
1.本發明首次發現了 UNC-51的激酶活性能夠直接地磷酸化肌動蛋白并和細胞微絲一起以粒狀構造分布到細胞質基質。UNC-51是第一個既磷酸化肌動蛋白也直接地影響微絲構造和分布的激酶。其關鍵發現為:在試管內的生化實驗中，UNC-51的激酶活性直接地磷酸化非肌肉細胞肌動蛋白，肌肉細胞肌動蛋白和秀麗線蟲肌動蛋白，在試管內和在活體內的生化實驗中，UNC-51結合非肌肉細胞肌動蛋白，肌肉...

【專利技術屬性】
技術研發人員：田懷澤，李素云，田華希，
申請(專利權)人：彩虹天健康科技研究北京有限責任公司，
類型：發明
國別省市：