本發明專利技術公開了含核定位序列NLS的融合蛋白NLS-I-SceI在制備介導哺乳動物基因轉移的試劑中的應用，融合蛋白NLS-I-SceI的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示，由核定位序列NLS與巨核酶I-SceI組成，核定位序列NLS位于巨核酶I-SceI的N端；該融合蛋白能夠在哺乳動物細胞內特異識別I-SceI識別位點，將兩端含有反向I-SceI識別位點的目標基因片段從質粒中切下，形成NLS-I-SceI-目標基因片段復合體；然后將復合體從胞質轉運至細胞核并整合入受體細胞基因組中，從而獲得轉基因細胞；將本發明專利技術公開的融合蛋白NLS-I-SceI作為制備轉基因哺乳動物的試劑，具有生物安全性高、便捷、效率高、適用范圍廣的優點。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于生物
，涉及融合蛋白NLS-1-SceI及其編碼的mRNA在制備介導哺乳動物基因轉移的試劑中的應用。
技術介紹
哺乳動物基因轉移技術是對哺乳動物基因組進行遺傳修飾、創制醫學轉基因動物模型和培育轉基因動物新品種的重要手段。現有的創制轉基因哺乳動物的主要技術有:胚胎細胞原核顯微注射、基于體細胞核移植(SCNT)的轉基因克隆、重組病毒載體感染、轉座子介導基因轉移和精子介導基因轉移(SMGT)等。胚胎細胞原核顯微注射是將含目的基因序列的DNA片段導入動物受精卵原核，以實現轉基因在基因組中的整合并由此獲得轉基因動物，是培育轉基因哺乳動物的經典方法，但該技術效率很低。已有研究表明(Wall, et al.Therionology, 1996，45:57)，在胚胎細胞原核清晰度非常高的小鼠中，通過胚胎細胞原核顯微注射研制轉基因小鼠的效率(獲得的轉基因動物數/移植的胚胎數)平均僅為2.6%，所獲得的首建動物中轉基因陽性率低于10%。在小鼠以外的哺乳動物、尤其是大動物(如豬、牛、羊等)中，由于胚胎細胞原核清晰度差，基于胚胎細胞原核顯微注射的轉基因效率更低。例如，利用胚胎細胞原核顯微注射制備轉基因豬的效率一般低于l%(Hammer RE et al.Nature, 1985，315:680)、部分報道中僅為 0.3% (Matrin et al.Transgenic Research, 2005, 14:373),而首建豬中轉基因陽性率一般低于5%。由于大動物購買、飼養及實驗成本昂貴，該技術的低效率已嚴重制約了轉基因大動物的規模化制備。為了克服胚胎原核顯微注射技術的不足，轉基因克隆技術已被廣泛地應用于轉基因哺乳動物、尤其是大動物的制備。轉基因克隆技術是以含有目的基因的轉基因細胞為供核細胞，通過體細胞核移植 將轉基因供核細胞核導入去核的卵母細胞中，由此構建含有轉基因的克隆胚胎，再通過克隆胚胎發育獲得轉基因個體。該技術由于以轉基因細胞為供核細胞，理論上可實現首建動物100%的轉基因陽性率。但是，由于克隆胚胎發育率低，導致轉基因克隆效率(獲得的轉基因克隆動物數/移植的克隆胚胎數)很低(一般低于3%) (Daiet al.Nature Biotechnology; Lai et al.Science, 2002， 295: 1089; Kues et al.Trends Biotechnology, 2004，22: 286)。其次，由于克隆動物經常會出現發育異常，導致轉基因克隆動物圍產期死亡率和夭折率均較高(可高達40%)。再次，由于轉基因供核細胞的制備需要藥物抗性篩選，導致獲得的轉基因克隆動物的基因組中含有藥物抗性基因，存在生物安全隱患，限制了轉基因動物的應用范圍(如食品、生物材料及制品等)。此外，轉基因克隆技術需要大規模采集動物卵母細胞，需要大量、穩定的卵巢來源，因此該技術只能常規應用于長期開展規模化屠宰的經濟類動物(如豬、牛、羊等)，不適用于非經濟類模式動物(如犬、猴等)。重組病毒載體(主要為基于HIV-1等逆轉錄病毒基因組改造的慢病毒載體)感染是高效的轉基因動物制備技術，其轉基因動物制備效率可達14-31%，首建動物轉基因陽性率可達 60-95%(Lois et al.Science, 2002, 295:868; Whitelaw et al.FEBS Letter,2004，571:233; Hoffman et al.EMBO Reports, 2003, 4:1054)，但該技術仍有諸多缺陷:首先，該技術需要高滴度的重組病毒顆粒懸液，而高滴度病毒的包裝、濃縮與純化是復雜、繁瑣的生物學過程，且生物安全度要求高；其次，重組病毒載體源自于致病的病毒基因組(如HIV-1)，其存在著生物安全隱患，嚴重限制了轉基因動物的應用。轉座子介導的轉基因技術是有效的制備轉基因動物的方法，但該技術需要在轉基因載體中添加轉座子元件，導致轉基因整合至動物基因組后仍具備可移動性，仍然存在類似病毒載體的生物安全隱患。精子介導基因轉移技術被認為是簡便和低成本的大動物轉基因技術，但由于該技術重復性差、高度不穩定，導致其目前并未成為制備轉基因哺乳動物的常規技術。
技術實現思路
有鑒于此，本專利技術的目的在于提供一種融合蛋白NLS-1-SceI的應用，該融合蛋白能夠特異識別1-SceI識別位點，將兩端含有反向1-SceI識別位點的目標基因片段切下；本專利技術的目的之二在于提供編碼上述融合蛋白NLS-1-SceI的mRNA的應用。為達到上述目的，本專利技術提供如下技術方案: 1.含核定位序列NLS的融合蛋白NLS-1-SceI在制備介導哺乳動物基因轉移的試劑中的應用，所述融合蛋白NLS-1-SceI的氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示。優選的，編碼所述融合蛋白NLS-1-SceI的核苷酸序列如SEQ ID N0.5所示。 更優選的，所述哺乳動物為豬或鼠。2.編碼權利要求1所述融合蛋白NLS-1-SceI的mRNA在制備介導哺乳動物基因轉移的試劑中的應用。本專利技術的有益效果在于:本專利技術公開了將含有核定位序列NLS的融合蛋白NLS-1-SceI用于制備介導哺乳動物基因轉移的試劑，可以用于介導哺乳動物基因轉移，制備轉基因哺乳動物，并具有如下優點: (I)生物安全性高，與病毒載體轉基因系統和轉座子載體系統相比，本技術僅需在轉基因載體中添加巨核酶1-SceI的識別序列，無需添加轉座子或病毒載體等序列，整合至動物基因組的轉基因拷貝無可移動性；與轉基因克隆技術相比，本技術在轉基因載體中無需添加藥物抗性基因，獲得的轉基因動物的基因組中亦無藥物抗性基因。(2)更簡便，本技術僅需將融合蛋白NLS-1-SceI或者編碼融合蛋白NLS-1-SceI的mRNA與兩端含有反向1-SceI識別位點的目標基因序列同時導入哺乳動物胚胎細胞的胞質，即可有效實現基因轉移、獲得轉基因動物；與轉基因克隆技術相比無需繁瑣的體外細胞培養、轉基因細胞篩選以及大規模的核移植等步驟；與病毒載體轉基因系統相比，省去了病毒包裝、濃縮與純化等繁瑣步驟。(3)具備穩定的高效率，利用本專利技術所建立的技術，首建動物的轉基因陽性率穩定在50%以上，轉基因動物的培育效率(轉基因動物數/移植胚胎數)穩定在8%以上，數倍高于胚胎細胞原核顯微注射技術和轉基因克隆技術；本技術制備轉基因動物的效率穩定，可常規用于轉基因動物培育，有效克服了精子介導基因轉移技術所存在的高度不穩定、不能常規用于轉基因動物培育的缺點。(4)種屬適用范圍廣，本技術僅需將巨核酶1-SceI分子及其配套轉基因載體同時導入哺乳動物胚胎細胞的胞質，而無需導入胚胎細胞原核，即可高效培育轉基因動物；因此，與胚胎細胞原核顯微注射技術相比，不依賴于清晰可見的胚胎細胞原核，適用于各種動物種屬、尤其是胚胎細胞原核清晰度低的大動物；與轉基因克隆技術相比，無需采集大量的卵母細胞用于核移植，適用于不能從屠宰場大規模采集卵巢以獲取卵母細胞的非經濟類哺乳動物(如非人靈長類動物、犬類等)。附圖說明為了使本專利技術的目的、技術方案和有益效果更加清楚，本專利技術提供如下附圖進行說明:圖1為與NLS-1-SceI分子配套的轉基因載體p2Is結構圖。圖2為融合分子NLS-1-Sc本文檔來自技高網...
【技術保護點】
含核定位序列NLS的融合蛋白NLS?I?SceI在制備介導哺乳動物基因轉移的試劑中的應用，所述融合蛋白NLS?I?SceI的氨基酸序列如SEQ?ID?NO.2所示。
【技術特征摘要】
1.含核定位序列NLS的融合蛋白NLS-1-SceI在制備介導哺乳動物基因轉移的試劑中的應用，所述融合蛋白NLS-1-SceI的氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示。2.根據權利要求1所述的應用，其特征在于:編碼所述融合蛋白NL...
【專利技術屬性】
技術研發人員：王勇，魏泓，周曉楊，向鵬英，
申請(專利權)人：中國人民解放軍第三軍醫大學，
類型：發明
國別省市：
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