一種觀測融合蛋白長距離轉運至水稻葉芽的方法技術

本發明專利技術公開了一種觀測融合蛋白長距離轉運至水稻葉芽的方法，該方法將GFP融合蛋白處理水稻根尖后，處理過根尖的水稻植株葉芽進行冷凍切片，切片后PI熒光染料進行染色，共聚焦顯微鏡直接觀測GFP融合蛋白從水稻根尖轉運至葉芽。該方法利用GFP融合蛋白處理水稻根尖0.5cm處，葉芽被冷凍切片后PI染色，共聚焦顯微鏡觀測GFP融合蛋白從水稻根尖轉運至葉芽，能直接定性地了解GFP融合蛋白在水稻植株內的長距離轉運情況。GFP融合蛋白直接處理水稻根尖0.5cm處，共聚焦顯微鏡觀測GFP融合蛋白轉運至葉芽可為進一步開展效應蛋白能引起水稻系統防御反應提供非常強有力的證據。該方法簡便、準確、快速。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及一種利用GFP融合蛋白處理水稻根尖觀測融合蛋白長距離轉運至水稻葉芽的方法，具體涉及一種利用融合GFP的稻瘟病菌蛋白基因的原核表達產物處理水稻根尖0.5cm處，激光共聚焦顯微鏡觀測GFP融合蛋白從根尖0.5cm處轉運至水稻葉芽的方法，屬于植物保護和細胞生物學領域。
技術介紹
病原細菌是通過III型分泌系統轉運效應子，其轉運機制研究得較為清楚。但對于絲狀真菌來說，盡管諸如吸器等專化的侵染結構參與了效應蛋白的轉運，但其效應蛋白是如何被轉運進入寄主細胞仍然未知。卵菌效應蛋白都具有一個保守的基序即RXLR，該基序位于 目號妝下游并且參與效應蛋白在寄主細胞內的轉運。許多研究表明，RXLR基序在卵菌效應蛋白轉運進入寄主細胞中起作用。綠色突光蛋白(green fluorescence protein, GFP)作為基因標記已經完全應用于微觀定位和數量性狀的測定，利用原核表達技術構建效應蛋白基因與GFP基因融合的原核表達載體，通過化學方法誘導融合蛋白表達，利用融合蛋白處理水稻根尖，將融合蛋白處理過根尖的水稻植株的葉芽進行冷凍切片，用熒光染料對切片進行染色，共聚焦顯微鏡觀測效應蛋白在水稻植株體內的轉運。稻瘟病菌效應蛋白能在水稻根組織內的轉運已有報道，但目前還沒有關于稻瘟病菌蛋白在水稻植株體內轉運，即從水稻根尖轉運至葉芽的報道
技術實現思路
本專利技術的目的是克服現有技術之不足，而提供一種快速、簡便、準確的用GFP融合蛋白處理水稻根尖0.5cm處，葉芽進行冷凍切片，PI熒光染料進行切片染色，共聚焦顯微鏡觀測GFP融合蛋白從水稻根尖轉運至葉芽的方法。本專利技術的技術方案是:，該方法將GFP融合蛋白處理水稻根尖后，處理過根尖的水稻植株葉芽進行冷凍切片，PI熒光染料進行切片染色后，共聚焦顯微鏡直接觀測GFP融合蛋白從水稻根尖轉運至葉芽。進一步，該方法的具體步驟是:5.0mg/ml的GFP融合蛋白處理種子發芽至14天的水稻幼嫩植株的根尖0.5cm處24h，滅菌水漂洗4h，葉芽進行冷凍切片，PI對切片進行染色，共聚焦顯微鏡直接觀測GFP融合蛋白在水稻植株內的轉運；將稻瘟病菌效應蛋白基因表達產物于4°C離心機離心收集菌體，用新鮮配制的緩沖液懸浮菌體；在冰水浴上進行超生破碎細胞后離心收集上清。處理是將該基因的原核表達產物純化后按照5.0mg/ml的濃度處理種子發芽至14天的黑谷幼嫩植株的根尖0.5cm處24h，滅菌水漂洗4h，葉芽進行冷凍切片，PI對切片染色，共聚焦顯微鏡觀測GFP融合蛋白在水稻植株內的轉運。共聚焦顯微鏡觀測到GFP融合蛋白已經從水稻根尖轉運到葉芽。進一步，緩沖液為20mM Tris-HCl,pH7.4 ；200mM NaCl ；lmM EDTA ;IOmMβ -巰基乙醇。本專利技術的有益效果在于:1、方法簡便、準確、快速。2、利用GFP融合蛋白處理水稻根尖0.5cm處，葉芽被冷凍切片后PI染色，共聚焦顯微鏡觀測GFP融合蛋白從水稻根尖轉運至葉芽，能直接定性地了解GFP融合蛋白在水稻植株內的長距離轉運情況。3、GFP融合蛋白直接處理水稻根尖0.5cm處，共聚焦顯微鏡觀測GFP融合蛋白轉運至葉芽可為進一步開展效應蛋白能引起水稻系統防御反應提供非常強有力的證據。具體實施例方式為了使本專利技術的目的、技術方案及優點更加清楚明白，以下結合實施例，對本專利技術進行進一步詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本專利技術，并不用于限定本專利技術。5.0mg/ml的GFP融合蛋白處理種子發芽至14天的水稻幼嫩植株的根尖0.5cm處24h，滅菌水漂洗4h，葉芽進行冷凍切片，PI對切片進行染色，共聚焦顯微鏡直接觀測GFP融合蛋白在水稻植株內的轉運。將稻瘟病菌效應蛋白基因表達產物于4°C離心機離心收集菌體，用新鮮配制的緩沖液(20mM Tris-HCl, pH7.4 ；200mM NaCl ；lmM EDTA ;IOmMβ -巰基乙醇)懸浮菌體。在冰水浴上進行超生破碎細胞后離心收集上清。處理是將該基因的原核表達產物純化后按照5.0mg/ml (含25mM MES)的濃度處理種子發芽至14天的麗江新團黑谷幼嫩植株的根尖0.5cm處24h，滅菌水漂洗4h，葉芽進行冷凍切片，PI對切片染色，共聚焦顯微鏡觀測GFP融合蛋白在水稻植株內的轉運。共聚焦顯微鏡觀測到GFP融合蛋白已經從水稻根尖轉運到葉芽。以上所述僅為本專利技術的較佳實施例而已，并不用以限制本專利技術，凡在本專利技術的精神和原則之內所作的任何修改、等同替換和改進等，均應包含在本專利技術的保護范圍之內。權利要求1.，其特征在于，該方法將GFP融合蛋白處理水稻根尖后，處理過根尖的水稻植株葉芽進行冷凍切片，切片后PI熒光染料進行染色，共聚焦顯微鏡直接觀測GFP融合蛋白從水稻根尖轉運至葉芽。2.如權利要求1所述的觀測融合蛋白長距離轉運至水稻葉芽的方法，其特征在于，該方法的具體步驟是: 5.0mg/ml的GFP融合蛋白處理種子發芽至14天的水稻幼嫩植株的根尖0.5cm處24h,滅菌水漂洗4h，葉芽進行冷凍切片，PI對切片進行染色，共聚焦顯微鏡直接觀測GFP融合蛋白在水稻植株內的轉運； 將稻瘟病菌效應蛋白基因表達產物于4°C離心機離心收集菌體，用新鮮配制的緩沖液懸浮菌體； 在冰水浴上進行超生破碎細胞后離心收集上清。處理是將該基因的原核表達產物純化后按照5.0mg/ml的濃度處理種子發芽至14天的黑谷幼嫩植株的根尖0.5cm處24h，滅菌水漂洗4h，葉芽進行冷凍切片，PI對切片染色，共聚焦顯微鏡觀測GFP融合蛋白在水稻植株內的轉運。共聚焦顯微鏡觀測到GFP融合蛋白已經從水稻根尖轉運到葉芽。3.如權利要求1所述的觀測融合蛋白長距離轉運至水稻葉芽的方法，其特征在于，緩沖液為 20mM Tris-HCl, pH7.4 ；200mM NaCl ；lmM EDTA ;10πιΜβ -巰基乙醇。全文摘要本專利技術公開了，該方法將GFP融合蛋白處理水稻根尖后，處理過根尖的水稻植株葉芽進行冷凍切片，切片后PI熒光染料進行染色，共聚焦顯微鏡直接觀測GFP融合蛋白從水稻根尖轉運至葉芽。該方法利用GFP融合蛋白處理水稻根尖0.5cm處，葉芽被冷凍切片后PI染色，共聚焦顯微鏡觀測GFP融合蛋白從水稻根尖轉運至葉芽，能直接定性地了解GFP融合蛋白在水稻植株內的長距離轉運情況。GFP融合蛋白直接處理水稻根尖0.5cm處，共聚焦顯微鏡觀測GFP融合蛋白轉運至葉芽可為進一步開展效應蛋白能引起水稻系統防御反應提供非常強有力的證據。該方法簡便、準確、快速。文檔編號G01N21/64GK103175810SQ20121055473公開日2013年6月26日 申請日期2012年12月5日 優先權日2012年12月5日專利技術者楊靜, 李成云, 劉林, 朱有勇, 杜云龍, 徐暢, 施竹鳳 申請人:云南農業大學本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種觀測融合蛋白長距離轉運至水稻葉芽的方法，其特征在于，該方法將GFP融合蛋白處理水稻根尖后，處理過根尖的水稻植株葉芽進行冷凍切片，切片后PI熒光染料進行染色，共聚焦顯微鏡直接觀測GFP融合蛋白從水稻根尖轉運至葉芽。

【技術特征摘要】

【專利技術屬性】
技術研發人員：楊靜，李成云，劉林，朱有勇，杜云龍，徐暢，施竹鳳，
申請(專利權)人：云南農業大學，
類型：發明
國別省市：