本發明專利技術公開了一種阿特拉津的快速檢測方法，屬于檢驗技術領域，本發明專利技術首先通過APTES法對聚苯乙烯微孔板表面進行氨基化修飾，利用羧基化阿特拉津的羧基與微孔板表面的氨基反應將羧基化阿特拉津直接包被到微孔板表面。基于氨基化微孔板建立了直接包被ELISA用于阿特拉津的檢測，該方法減少了封閉步驟并且省去了小分子半抗原與蛋白的偶聯復雜過程，具有較高的靈敏度和穩定性，因此該方法更加適用于阿特拉津殘留的分析與監測。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及一種可用于阿特拉津快速檢測的ELISA方法，特別涉及直接包被ELISA檢測方法，屬于檢驗
，建立的直接包被ELISA檢測方法可以用于研制阿特拉津免疫速測試劑盒。
技術介紹
除草劑阿特拉津(Atrazine，AT)又名莠去津，全稱:2_氯_4_乙胺基_6_異丙氨基-1，3，5-三氮苯，分子式C8H14ClN5,分子量為215.69。阿特拉津純品為無色無臭晶體，性質穩定，熔點175 177°C，蒸汽壓40.00 μ Pa (20°C )，在水中溶解度為281^171,甲醇中的溶解度為l.SgL—1，氯仿中溶解度為52gL'主要適用于苗前土壤處理和苗后早期莖葉兼土壤噴霧處理，可防除一年生禾本科雜草，對某些多年生雜草也有一定的抑制作用。從1952年瑞士 Ciba-Geigy開發生產以來,阿特拉津在全球范圍大面積使用。據統計，1980年全世界釋放到環境中的阿特拉津達到9X IO4噸。從1980到1990年，平均每年噴灑量達3.6 X IO4噸。阿特拉津雖然是一種低毒除草劑，但其在環境中不易被分解，半存留期長達57周。噴灑后，僅有少部分落到靶標上，大部分進入到土壤、河流、湖泊，對地下水和地表水造成污染。阿特拉津具有一定的生物毒性，在水中到達一定濃度時，能夠抑制水中多種藻類物質的光合作用 ，同時導致魚類體內Ca2+、Mg2+等離子濃度明顯下降，致使生理功能紊亂。阿特拉津對人畜有一定的毒性危害，對眼睛和皮膚具有刺激作用，還能經口、皮膚等部位進入血液循環，使心臟、肝腎、血管等出現中毒癥狀。低濃度長期暴露會干擾人畜內分泌系統，甚至引發癌癥。阿特拉津的嚴重危害問題已經引起人們的高度重視。歐盟在飲用水標準中對阿特拉津的濃度做出限制，規定其濃度不得超過0.1yg L—1。美國環境保護局規定阿特拉津在水中濃度不得高于3 μ gL'我國《地表水環境質量標準》(GB3838-2002)規定其標準限值為3 μ gL'因此必須建立快速、靈敏的檢測分析方法，以確保環境安全和人類健康。阿特拉津測定最常采用的有色譜法、色質聯用法等。我國新修訂的《生活飲用水標準檢驗方法》(GB/T5750.8-2006)采用固相萃取-氣相色譜-質譜法檢測阿特拉津。衛生部編寫的《食品中的阿特拉津殘留量的測定》(GB/T16336-1996)使用氣相色譜法進行監測。但是這些儀器方法前處理費事、成本高、不適合現場檢測，而ELISA具有靈敏度高、選擇性好等優點，避免了經典儀器測試手段的不足，能夠用于現場快速監測。
技術實現思路
本專利技術的目的是提供一種直接包被ELISA方法用于阿特拉津的快速檢測。本專利技術的技術方案概述如下:一種用于阿特拉津快速檢測的直接包被ELISA方法，具體步驟如下1.微孔板表面氨基化修飾使用3-氨基丙基三乙氧基甲硅烷(APTES)進行氨基化修飾。首先在微孔內加入HNO3和H2SO4混合液(v/v = 47/53)，每孔250 μ L，室溫反應30min。倒去濃酸后，用去離子水洗滌兩次，每孔250 μ L。再加入5%氨丙基三乙氧基硅烷(HCl調節pH為5.5 6.9)的水溶液，每孔100 μ L，室溫反應2h。去離子水洗滌兩次后放入62°C烘箱中反應2h。2.羧基化阿特拉津的直接包被IOmg阿特拉津、NHS 6mg、DCC 12mg溶解于2mL10% DMF中，室溫下緩慢振搖反應12小時，12000r/min離心IOmin后去除沉淀物以活化羧基化阿特拉津，每孔加入ΙΟΟμ L適當濃度活化后的羧基化阿特拉津，4°C反應過夜。PBST洗滌后，加0.2mol/L甲醛溶液37°C孵育I小時，封閉除去多余的氨基。洗滌后干燥保存。3.直接包被ELISA檢測阿特拉津方法的建立在固定好羧基化阿特 拉津的酶標板中，加入50 μ L阿特拉津抗體和一系列濃度(0,0.025,0.12,0.6,3.2，16，80，400，2000，10000，50000ng mL-1)阿特拉津小分子，37°C孵育1.5h，PBST洗滌四次后，每孔加入100 μ L羊抗小鼠二抗，37°C反應45分鐘。PBST洗滌6次，每孔加100 μ L底物顯色液，37°C孵育10分鐘后每孔中加50 μ L 2mol終止反應，酶標儀進行讀數。本專利技術的有益效果:直接包被ELISA用于阿特拉津檢測具有較高的靈敏度，通過實際樣品加標回收分析，氨基化阿特拉津直接包被ELISA表現出較高的穩定性和精確度，該方法相比傳統包被完全抗原的ELISA方法相比，更簡單快速。附圖說明圖1APTES法氨基化聚苯乙烯微孔板原理圖。具體實施例方式以下的實施例便于更好地理解本專利技術，但并不限定本專利技術。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的試劑與材料，如無特殊說明，均可從常規試劑公司購買得到。實施例1，直接包被ELISA檢測方法的建立與評估一.方法的靈敏度1.微孔板表面氨基化和羧基化阿特拉津直接包被使用3-氨基丙基三乙氧基甲硅烷(APTES)進行氨基化修飾。首先在微孔內加入HNO3和H2SO4混合液(v/v = 47/53)，每孔250 μ L，室溫反應30min。倒去濃酸后，用去離子水洗滌兩次，每孔250 μ L。再加入5%氨丙基三乙氧基硅烷(HCl調節pH為5.5 6.9)的水溶液，每孔100 μ L，室溫反應2h。去離子水洗滌兩次后放入62°C烘箱中反應2h即可完成氨基化修飾。其原理圖見圖1。微孔板氨基化處理完成后，IOmg羧基化阿特拉津、NHS 6mg、DCC 12mg溶解于2mL有機溶劑中，室溫下緩慢振搖反應12小時，12000r/min離心IOmin后去除沉淀物以活化羧基化阿特拉津，每孔加入ΙΟΟμ L適當濃度活化后的羧基化阿特拉津，4°C反應過夜。PBST洗滌后，加一定濃度甲醛溶液37°C孵育I小時，封閉除去多余的氨基。洗滌后干燥保存。2.常規ELISA包被過程0.05mol Ι^ΡΗ9.6碳酸鹽緩沖液將阿特拉津-OVA偶聯物稀釋到適當濃度加入到微孔板內，每孔ΙΟΟμ L4°C反應過夜。傾去包被液,滅菌水洗一次,拍干。每孔加入150yL1% 0VA，37°C反應1.5小時，除去封閉液。3.常規ELISA與直接包被ELISA檢測阿特拉津分析方法的建立在固定好羧基化阿特拉津以及全抗原的酶標板中，加入50 μ L阿特拉津抗體和一系列濃度(0,0.025,0.12,0.6, 3.2,16,80,400, 2000,10000, 50000ng mL-1)阿特拉津小分子，37°C孵育1.5h，PBST洗滌四次后，每孔加入100 μ L羊抗小鼠二抗，37°C反應45分鐘。PBST洗滌6次，每孔加100 μ L底物顯色液，37°C孵育10分鐘后每孔中加50 μ L 2molL-1H2SO4終止反應，酶標儀進行讀數。根據下述公式求出ELISA競爭抑制率:本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種阿特拉津直接包被ELISA檢測方法，具體步驟如下：(1)微孔板表面氨基化修飾：使用3?氨基丙基三乙氧基甲硅烷(APTES)進行氨基化修飾；首先在微孔內加入HNO3和H2SO4混合液(v/v＝47/53)，每孔250μL，室溫反應30min；倒去濃酸后，用去離子水洗滌兩次，每孔250μL；再加入5％氨丙基三乙氧基硅烷(HCl調節pH為5.5～6.9)的水溶液，每孔100μL，室溫反應2h；去離子水洗滌兩次后放入62℃烘箱中反應2h；(2)羧基化阿特拉津的直接包被：10mg阿特拉津、NHS?6mg、DCC?12mg溶解于2mL10％DMF中，室溫下緩慢振搖反應12小時，12000r/min離心10min后去除沉淀物以活化羧基化阿特拉津，每孔加入100μL適當濃度活化后的羧基化阿特拉津，4℃反應過夜；PBST洗滌后，加入0.2mol/L甲醛溶液37℃孵育1小時，封閉除去多余的氨基；洗滌后干燥保存；(3)直接包被ELISA檢測阿特拉津方法的建立：在固定好羧基化阿特拉津以及全抗原的酶標板中，加入50μL阿特拉津抗體和一系列濃度(0，0.025，0.12，0.6，3.2，16，80，400，2000，10000，50000ngmL?1)阿特拉津小分子，37℃孵育1.5h，PBST洗滌四次后，每孔加入100μL羊抗小鼠二抗，37℃反應45分鐘；PBST洗滌6次，每孔加100μL底物顯色液，37℃孵育10分鐘后每孔中加50μL?2molL?1?H2SO4終止反應，酶標儀進行讀數。...
【技術特征摘要】
1.一種阿特拉津直接包被ELISA檢測方法，具體步驟如下: (1)微孔板表面氨基化修飾:使用3-氨基丙基三乙氧基甲硅烷(APTES)進行氨基化修飾；首先在微孔內加入HNO3和H2SO4混合液(v/v = 47/53)，每孔250 μ L，室溫反應30min ；倒去濃酸后，用去離子水洗滌兩次，每孔250 μ L ;再加入5%氨丙基三乙氧基硅烷(HCl調節pH為5.5 6.9)的水溶液，每孔100 μ L，室溫反應2h ;去離子水洗滌兩次后放入62°C烘箱中反應2h ； (2)羧基化阿特拉津的直接包被:10mg阿特拉津、NHS6mg、DCC 12mg溶解于2mL10%DMF中，室溫下緩慢振搖反應12小時，12000r/min離心IOmin后去除沉淀物以活化羧基化阿特拉津...
【專利技術屬性】
技術研發人員：高志賢，白家磊，寧保安，彭媛，柳明，孫思明，
申請(專利權)人：中國人民解放軍軍事醫學科學院衛生學環境醫學研究所，
類型：發明
國別省市：
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