本發明專利技術公開了一種神經元特異性烯醇化酶含量檢測試劑盒及其制備方法，屬于人體神經元特異性烯醇化酶含量檢測領域。所述檢測試劑盒由彼此獨立的試劑Ⅰ和試劑Ⅱ組成，其中，試劑Ⅰ的組分包括：生物緩沖劑、防腐劑、促凝劑、無機鹽和水；試劑Ⅱ的組分包括：包被神經元特異性烯醇化酶抗體的膠乳顆粒、生物緩沖劑、防腐劑、助懸劑和水。本發明專利技術用神經元特異性烯醇化酶單克隆體和多克隆抗體復合包被粒徑為80-240nm的膠乳顆粒，保證檢測試劑盒具有高靈敏度及較寬的檢測線性范圍，具有操作簡便、快速、特異性強、穩定性好，靈敏度高等優點。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及一種人體內酶含量的檢測試劑盒，尤其涉及人體內神經元特異性烯醇化酶含量的檢測試劑盒及其制備方法，屬于人體神經元特異性烯醇化酶含量的檢測領域。
技術介紹
小細胞肺癌(Small Cell Lung Cancer，SCLC)約占肺癌的20%，惡性程度高，倍增時間短，轉移早而廣泛，對化療、放療敏感，初治緩解率高，但極易發生繼發性耐藥，容易復發，治療以全身化療為主。如果能在發病后早辨別高危患者并及時進行治療，則小細胞肺癌的病死率及預后將會有明顯改善。因此，在SCLC的診斷及預后過程中，腫瘤標志物具有重要的作用。 近年來,神經元特異性烯醇化酶(neuron-specific enolase,NSE)作為SCLC的腫瘤標志物，被廣泛的應用于醫療診斷。神經元特異性烯醇化酶(NSE)是參與糖酵解途徑的烯醇化酶中的一種，存在于神經組織和神經內分泌組織中。NSE在腦組織細胞的活性最高，外周神經和神經分泌組織的活性水平居中，最低值見于非神經組織、血清和脊髓液。NSE存在4種二聚體同功酶(αα，αβ，αγ，ββ和γγ)形式,它們由三種不同的亞單位α，β，Y組成。小細胞肺癌患者的NSE水平明顯高于肺腺癌、肺鱗癌、大細胞肺癌等非小細胞肺癌(NSCLC)，可用于鑒別診斷。并且小細胞肺癌治療有效時NSE濃度逐漸降低至正常水平，復發時血清NSE升高，神經元特異性烯醇化酶監測小細胞肺癌的復發，比臨床確定復發要早4 12周。神經元特異性烯醇化酶還可用于神經母細胞瘤和腎母細胞瘤的鑒別診斷，前者神經元特異性烯醇化酶異常增高而后者增高不明顯，對神經母細胞瘤的早期診斷亦有較高的臨床應用價值，也可用來監測神經母細胞瘤的病情變化，評價療效和預報復發。還有神經內分泌細胞腫瘤，如嗜鉻細胞瘤，胰島細胞瘤，甲狀腺髓樣癌，黑色素瘤，視網膜母細胞瘤等患者的血清NSE含量也會增高。研究還發現腫瘤患者血清中NSE含量的動態變化可以作為預測癌細胞是否有腦轉移趨勢的一個重要指標。目前臨床上神經元特異性烯醇化酶的測定方法主要有放免法、ELLSA法、化學發光法，其中酶聯免疫法自動化程度不高，且受人為操作因素影響很大；放射免疫法存在著放射物質的污染問題；而化學發光法靈敏度雖高，但測定線性范圍較小且檢測成本較高，需要配套的化學發光檢測儀，這些原因導致其應用范圍較小。迄今為止，臨床上缺乏一種操作簡單、靈敏度高、線性范圍寬的檢測神經元特異性烯醇化酶(NSE)含量的試劑盒。
技術實現思路
本專利技術的目的之一是提供一種操作簡單、靈敏度高、線性范圍寬的神經元特異性烯醇化酶(NSE)含量檢測試劑盒。本專利技術的目的之二是提供一種所述神經元特異性烯醇化酶(NSE)含量檢測試劑盒的制備方法。本專利技術的上述目的是通過以下技術方案來實現的:一種神經元特異性烯醇化酶(NSE)含量檢測試劑盒，由彼此獨立的試劑I和試劑II組成，所述試劑I的組分包括:生物緩沖劑、防腐劑、無機鹽、促凝劑和水；所述試劑II的組分包括:包被神經元特異性烯醇化酶抗體的膠乳顆粒、生物緩沖劑、助懸劑、防腐劑和水。本專利技術通過大量的試驗發現，包被神經元特異性烯醇化酶抗體的膠乳顆粒的粒徑的大小對于檢測的靈敏性、準確性及線性范圍等有著非常顯著的影響，本專利技術通過大量的試驗最終確定，當包被神經元特異性烯醇化酶抗體的膠乳顆粒的粒徑為80-240nm時,相比于其它的粒徑的膠乳顆粒，其檢測的靈敏度及線性范圍等特性有非常顯著的改善。由此，本專利技術試劑盒中的包被神經元特異性烯醇化酶抗體的膠乳顆粒的粒徑優選為80-240nm，采用此粒徑的膠乳顆粒制備的檢測試劑盒其靈敏度及線性范圍廣等特性明顯優于其它粒徑的包被神經元特異性烯醇化酶抗體的膠乳顆粒。其中，當包被神經元特異性烯醇化酶抗體的膠乳顆粒的粒徑為150nm時，檢測的靈敏度及線性范圍能達到最好的效果。制備包被神經元特異性烯醇化酶抗體的膠乳顆粒可以有多種制備方法，諸如化學交聯法、物理吸附法等；本專利技術通過實驗發現，采用化學交聯法制備的致敏膠乳顆，神經元特異性烯醇化酶抗體與膠乳顆粒結合緊密，不容易從膠乳顆粒上脫落，提高了抗體結合的穩定性，可顯著提高檢測試劑盒的穩定性。作為一種優選的方案，本專利技術所述的包被神經元特異性烯醇化酶抗體的膠乳顆粒采用下述步驟進行制備:(I)洗滌膠乳；(2)活化膠乳；(3)致敏膠乳；(4)封閉膠乳；(5)洗滌。其中，優選的，所述的洗滌膠乳包括:將PBS緩沖液和表面活性劑依次加入到粒徑為80-240nm的膠乳溶液中混合均勻，離心棄上清，沉淀用PBS緩沖液復溶，超聲震蕩，使膠乳顆粒均勻分散；優選的，所述的活化膠乳包括:將1-乙基-3- (3-二甲基氨基丙基)碳化二亞胺(EDC)和N-羥基硫代琥珀酰亞胺(NHS)用磷酸鹽緩沖溶液溶解后加入步驟(I)的膠乳溶液中，震蕩混合均勻，置于25°C恒溫搖床反應；優選的，所述的致敏膠乳包括:向步驟(2)的反應溶液中加入神經元特異性烯醇化酶單克隆抗體和多克隆抗體，震蕩混合均勻，置于水平搖床上在室溫下進行反應；優選的，所述封閉膠乳包括:向步驟(3)的反應產物中加入甘氨酸溶液混合均勻，室溫下反應后，再向反應產物中加入BSA溶液，混合均勻，于室溫下反應；優選的，步驟(5)中所述的洗滌包括:將步驟(4)的反應產物離心棄上清，用超純水洗滌沉淀兩次，再用PBS緩沖液復溶，即得。本專利技術采用神經元特異性烯醇化酶(NSE)的單克隆抗體和神經元特異性烯醇化酶多克隆抗體采用化學交聯法復合包被膠乳顆粒，能夠有效提高測定結果的準確性。試劑I的pH值的范圍優選為7.0-8.0，試劑II的pH值的范圍優選為6.5-7.5。為了達到更好的檢測效果，本專利技術每I升試劑I中各組分的用量為:生物緩沖劑l-100g，促凝劑l_60g，防腐劑0.02-10g，無機鹽l_80g，余量為水；本專利技術的試劑II中包被神經元特異性烯醇化酶(NSE)單克隆抗體或多克隆抗體的膠乳顆粒，可特異性識別并結合血清或尿液中的NSE抗原，每I升試劑II中各組分的含量為:包被神經元特異性烯醇化酶抗體的膠乳顆粒0.05-10g,生物緩沖劑l_80g，助懸劑l-80mL,防腐劑0.02-10g,余量為水。進一步優選的，每I升試劑I中各組分的用量為:生物緩沖劑7_20g，促凝劑3-20g,防腐劑0.l-5g，無機鹽2-15g，余量為水；每I升試劑II中各組分的用量為:包被神經元特異性烯醇化酶抗體的膠乳顆粒0.5-5g，生物緩沖劑5-30g，助懸劑5-50mL，防腐劑0.l_6g，余量為水。最優選為:每I升試劑I中各組分的用量為:生物緩沖劑12.lg，促凝劑Sg，防腐劑lg，無機鹽10g，余量為水；每I升試劑II中各組分的用量為:包被神經元特異性烯醇化酶抗體的膠乳顆粒1.5g，生物緩沖劑10.5g，助懸劑20mL，防腐劑lg，余量為水。本專利技術所述的生物緩沖劑是能夠用于維持一定PH值的各種生物緩沖劑，例如三羥甲基氨基甲烷(Tris)、三羥甲基甲胺基乙磺酸(TES)、2-(N-嗎啡啉)乙磺酸(MES)、N-(2-羥乙基)哌嗪-N’ -2-乙烷磺酸(HEPES)、三羥甲基甲胺基丙磺酸(TAPS)、哌嗪-1，4- 二羥基丙磺酸(P0PS0)、3- (N-嗎啉)丙磺酸(MOPS)中的一種或是幾種；為了達到更好的檢測效果，本專利技術試劑I所述的本文檔來自技高網...
【技術保護點】
神經元特異性烯醇化酶含量的檢測試劑盒，其特征在于：該檢測試劑盒由彼此獨立的試劑Ⅰ和試劑Ⅱ組成；其中，試劑Ⅰ的組分包括：生物緩沖劑、防腐劑、促凝劑、無機鹽和水；試劑Ⅱ的組分包括：包被神經元特異性烯醇化酶抗體的膠乳顆粒、生物緩沖劑、防腐劑、助懸劑和水。
【技術特征摘要】
1.神經元特異性烯醇化酶含量的檢測試劑盒，其特征在于:該檢測試劑盒由彼此獨立的試劑I和試劑II組成；其中，試劑I的組分包括:生物緩沖劑、防腐劑、促凝劑、無機鹽和水；試劑II的組分包括:包被神經元特異性烯醇化酶抗體的膠乳顆粒、生物緩沖劑、防腐齊U、助懸劑和水。2.按照權利要求1所述的檢測試劑盒，其特征在于:所述包被神經元特異性烯醇化酶抗體的膠乳顆粒的粒徑是80-240nm,優選為150nm。3.按照權利要求1或2所述的檢測試劑盒，其特征在于:所述包被神經元特異性烯醇化酶抗體的膠乳顆粒由神經元特異性烯醇化酶單克隆抗體和神經元特異性烯醇化酶多克隆抗體復合包被粒徑是80-240nm的膠乳顆粒制備而成。4.按照權利要求1-3任何一項所述的檢測試劑盒，其特征在于，所述的包被神經元特異性烯醇化酶抗體的膠乳顆粒采用下述步驟制備得到:(I)洗滌膠乳；(2)活化膠乳；(3)致敏膠乳；(4)封閉膠乳；(5)洗滌。5.按照權利要求4所述的檢測試劑盒，其特征在于:所述的洗滌膠乳包括:將磷酸鹽緩沖液和表面活性劑依次加入到粒徑為80-240nm的膠乳溶液中混合均勻，離心棄上清，沉淀用磷酸鹽緩沖液復溶，超聲震蕩，使膠乳顆粒均勻分散； 所述的活化膠乳包括:將1-乙基-3- (3- 二甲基氨基丙基)碳化二亞胺和N-羥基硫代琥珀酰亞胺用磷酸鹽緩沖溶液溶解后加入步驟(I)的膠乳溶液中，震蕩混合均勻，置于恒溫搖床進行反應； 所述的致敏膠乳包括:向步驟(2)的反應溶液中加入神經元特異性烯醇化酶單克隆抗體和神經元特異性烯醇化酶多克隆抗體，震蕩混合均勻，置于水平搖床上在室溫下進行反應； 所述封閉膠乳包括:向步驟(3)的反應產物中加入甘氨酸溶液混合均勻，室溫下反應后，再向反應產物中加入 BSA溶液，混合均勻于室溫下反應； 步驟(5)中所述的洗滌包括:將步驟(4)的反應產物離心棄上清，用超純水...
【專利技術屬性】
技術研發人員：華權高，沈鶴霄，許可，閆彩霞，黃愛，伍衛姣，舒芹，鄢寶，趙暢，
申請(專利權)人：武漢華美生物工程有限公司，
類型：發明
國別省市：
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