抗癌腺病毒制造技術(shù)

本文提供了抗癌腺病毒、其使用方法和制備方法。

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
【國外來華專利技術(shù)】抗癌腺病毒相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用本申請(qǐng)要求2010年8月16日提交的美國臨時(shí)申請(qǐng)61/374,215的權(quán)益，所述臨時(shí)申請(qǐng)為了所有目的全部并入本文。對(duì)聯(lián)邦政府資助研發(fā)做出的專利技術(shù)的權(quán)利的聲明本專利技術(shù)是在NationalInstitutesofHealth授予的政府支持CA137094下做出的。政府對(duì)本專利技術(shù)擁有某些權(quán)利。專利技術(shù)背景有52種人類腺病毒感染不同的人組織，還有上百種腺病毒能夠感染從魚到靈長(zhǎng)動(dòng)物的其他物種。這些病毒是高效的納米級(jí)機(jī)器，能夠在感染1小時(shí)內(nèi)將它們的遺傳物質(zhì)有效負(fù)載至細(xì)胞核內(nèi)。這些DNA病毒不整合到宿主DNA中，利用成熟的GMP方案可以產(chǎn)生高滴度的病毒，而且它們?cè)跒榱吮磉_(dá)異位基因進(jìn)行的研究和人類基因治療應(yīng)用中表現(xiàn)很安全。但是，到目前為止，由于使用幾乎只限于一個(gè)變種Ad5或Ad2/5嵌合體以及不能快速和系統(tǒng)地構(gòu)建和組合多個(gè)基因修飾，它們的潛在應(yīng)用受到了局限。因此，需要將常用的腺病毒載體擴(kuò)展到Ad2/5以外，并且要建立一個(gè)技術(shù)平臺(tái)來協(xié)助由組成部分快速離體地組裝新的腺病毒基因組，以便能夠系統(tǒng)地引入多個(gè)修飾和異源元件。這樣的系統(tǒng)可以利用天然的病毒架構(gòu)在能夠高效運(yùn)送和表達(dá)36個(gè)基因(不包括剪接變體)方面的優(yōu)點(diǎn)。所述系統(tǒng)可以提供有力的診斷劑和治療劑，這些診斷劑和治療劑包含對(duì)不同腫瘤樣品中失去調(diào)控的途徑活性的多重和定量測(cè)量。腺病毒載體在多種應(yīng)用中的潛力受限于快速和系統(tǒng)地操縱36kb病毒基因組的能力。而且，基礎(chǔ)研究、動(dòng)物模型、基因治療和溶瘤治療中使用的腺病毒載體只限于腺病毒(Ad)血清型2和5。Ad2和Ad5居于最早發(fā)現(xiàn)的腺病毒之列，因此傳統(tǒng)上有大量載體/工具來操縱它們的基因組，特別是E1區(qū)域。Ad2/5纖維蛋白(Fiberproteins)通過結(jié)合受體CAR感染上皮細(xì)胞。不幸的是，不是所有類型的細(xì)胞都表達(dá)CAR，而且在許多轉(zhuǎn)移病例中被下調(diào)。再者，接近80%的人口具有預(yù)先存在的抗Ad2/5的中和抗體，這與脫靶肝攝取和炎癥一起限制了它的系統(tǒng)性應(yīng)用。因此，使用Ad2/5載體進(jìn)行基因遞送和癌癥治療不一定是最佳選擇，相反主要是歷史的偶然事件。我們的最終目的是建立強(qiáng)力的病毒癌癥療法，所述療法不僅能夠進(jìn)行腫瘤選擇性裂解復(fù)制，還可以在多輪治療中進(jìn)行系統(tǒng)地給藥、避免對(duì)肝臟的毒性、有效地靶向和穿越令人苦惱的腫瘤血管、經(jīng)由不同的受體感染細(xì)胞、在腫瘤內(nèi)通過前藥活化酶/毒素的局部表達(dá)產(chǎn)生腫瘤旁觀者效應(yīng)并且復(fù)蘇有益的宿主抗病毒免疫反應(yīng)。這些主要挑戰(zhàn)又因?yàn)槿祟愊俨《静荒茉谛∈笾袕?fù)制而更加嚴(yán)重。這排除了相比異種移植模型有許多優(yōu)勢(shì)的在免疫活性癌癥基因工程小鼠模型(GEMMs)中進(jìn)行人溶瘤病毒評(píng)價(jià)的可以。52種人類腺病毒的存在表明腺病毒高度專性適應(yīng)不同宿主組織環(huán)境中的感染和復(fù)制。這些病毒中有許多可以感染不同組織，并且具有與除CAR之外的細(xì)胞受體結(jié)合的纖維蛋白以及各不相同的“E3”免疫調(diào)節(jié)基因群。由于缺少修飾它們的基因組所需要的工具，對(duì)它們的這些獨(dú)特屬性還沒有廣泛的研究或利用。類似地，還存在感染其他物種的腺病毒，包括小鼠腺病毒(MAV-1)。本文提供了對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中的這些和其他問題的解決方案。專利技術(shù)概述專利技術(shù)一方面提供了經(jīng)過改造的腺病毒。所述經(jīng)過改造的腺病毒可以是p53復(fù)制受損型腺病毒。p53復(fù)制受損型腺病毒處于p53表達(dá)細(xì)胞內(nèi)時(shí)是復(fù)制受損的，但在p53受損型細(xì)胞內(nèi)時(shí)不是復(fù)制受損的。專利技術(shù)另一方面提供了治療癌癥的方法。所述方法包括將有效量(例如治療有效劑量或者用量)的經(jīng)過改造的腺病毒(如上所述)或者一或多個(gè)編碼經(jīng)過改造的腺病毒的核酸給予有此需要的受試對(duì)象。附圖簡(jiǎn)述圖1.腺病毒感染的原代或腫瘤細(xì)胞中E1B-55k的丟失或p53的降解誘導(dǎo)了p53水平，但對(duì)轉(zhuǎn)錄活性沒有影響，這與ARF表達(dá)無關(guān)。a.用模擬物、野生型(wt)或ΔE1B-55k(Δ55k)病毒感染人原代小氣道上皮細(xì)胞(SAECs)，并在感染后(hourspostinfection,h.p.i.)24、36和48小時(shí)收集。對(duì)蛋白裂解物進(jìn)行歸一化，并分析p53、p21、MDM2和ARF的表達(dá)情況。分析肌動(dòng)蛋白的表達(dá)作為上樣對(duì)照。b.用模擬物、wt或Δ55k病毒感染U2OS細(xì)胞并在28h.p.i.固定。通過免疫熒光檢測(cè)p53，用Hoechst染料將DNA復(fù)染。c.用模擬物、wt或Δ55k病毒感染U2OS細(xì)胞，在24、36和48h.p.i.收集。多柔比星(Doxorubicin,dox)處理12小時(shí)作為p53激活的陽性對(duì)照。將蛋白裂解物歸一化，并分析p53、p21和MDM2的表達(dá)。分析肌動(dòng)蛋白的表達(dá)作為上樣對(duì)照。d.用模擬物、wt或Δ55k病毒感染帶有異丙基β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)性ARF的U2OS穩(wěn)定細(xì)胞系(NARF細(xì)胞)。細(xì)胞不做處理或者在8h.p.i.加入IPTG以誘導(dǎo)ARF的表達(dá)。利用實(shí)時(shí)PCR在36h.p.i.定量p21和MDM2的mRNA水平(下方小圖)，作圖表示為相對(duì)于(withrespectto,wrt)模擬物感染的細(xì)胞(-ARF)的倍數(shù)改變；豎線代表三個(gè)重復(fù)的標(biāo)準(zhǔn)差。還收集(48h.p.i.)了蛋白裂解物，歸一化并分析p53、p21、MDM2和ARF的表達(dá)(上方小圖)。肌動(dòng)蛋白作為上樣對(duì)照。圖2.E1B-55k的缺失在感染腺病毒的細(xì)胞內(nèi)誘發(fā)了高水平磷酸化p53，而p53轉(zhuǎn)錄靶被明顯阻遏，不能被輻射、基因毒性藥物、ARF、MDM2拮抗劑或者組蛋白去乙酰化酶抑制劑激活。a.用模擬物、wt或Δ55k病毒感染U2OS細(xì)胞。樣品在24h.p.i.用介質(zhì)對(duì)照(-)或5-氟尿嘧啶(5-FU)處理。36h.p.i.收集蛋白裂解物，歸一化并分析p53和p21的表達(dá)。分析肌動(dòng)蛋白作為上樣對(duì)照。b.用模擬物、Δ55k或wt病毒感染SAECs。細(xì)胞不做處理或者在31h.p.i.用10Gy進(jìn)行γ-照射(IR)。在36h.p.i.收集蛋白裂解物(下方小圖)，歸一化并分析p53、p21和MDM2的表達(dá)。利用磷酸化特異性抗體檢測(cè)p53在絲氨酸(ser)15處的磷酸化。肌動(dòng)蛋白作為上樣對(duì)照。還在36h.p.i.收集了總RNA，并通過實(shí)時(shí)PCR定量p53的轉(zhuǎn)錄靶(上方小圖)。將PUMA、MDM2、p21、GADD45A和14-3-3σ的水平作圖為相對(duì)于(wrt)未感染細(xì)胞在0小時(shí)的倍數(shù)改變；豎線代表三個(gè)重復(fù)的標(biāo)準(zhǔn)差。c.用模擬物或Δ55k病毒感染SAECs，并在36h.p.i.收集。多柔比星(dox)處理12小時(shí)作為p53活化的陽性對(duì)照。將蛋白裂解物歸一化，并通過Western印跡分析總的p53和p21水平。利用p53磷酸化特異性抗體確定p53在ser6和9(酪蛋白激酶1)、ser15(ATM、ATR、DNA-PK)、ser20(CHK1、CHK2、JNK、MAPKAP2)、ser33(p38、PIN1)、ser46(HIPK2和DYRK2)、蘇氨酸(thr)81(JNK、PIN1)、ser315(Aurora激酶、PIN1、CDK2和GSK-3)和ser392(PKR、CDK9和p38FACT-CK2)3的磷酸化。d.用模擬物、wt或Δ55k病毒感染SAECs。樣品在24h.p.i.用介質(zhì)對(duì)照(-泳道)、多柔比星(dox)、MDM2拮抗劑、nutlin或曲古菌素(trichostatinA,TS本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】

【技術(shù)特征摘要】
【國外來華專利技術(shù)】2010.08.16 US 61/374,2151.重組腺病毒在制備用于治療由p53受損的細(xì)胞造成的癌癥的藥物中的用途，其中所述重組腺病毒是E1B-55k受損的和E4-ORF3受損的。2.如權(quán)利要求1所述的用途，其中所治療的癌癥的特征在于p53的表達(dá)或者活性降低。3.如權(quán)利要求1所述的用途，其中所述p53受損的細(xì)胞包含突變的p53基因。4.如權(quán)利要求1所述的用途，其中所述p53受損的細(xì)胞包含的基因組中p53基因被完全或者部分缺失。5.如權(quán)利要求1所述的用途，其中所述癌癥是肺癌、皮膚癌或者乳腺癌。6.如權(quán)利要求1所述的用途，其中所述要治療的癌癥是惡化前乳腺癌。7.如權(quán)利要求1所...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：C奧謝，C鮑爾斯，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：薩克生物研究學(xué)院，
類型：
國別省市：