一種雜交和牛的培育方法技術

本發明專利技術提供了一種雜交和牛的培育方法，包括雜交和牛胚胎體外培養和胚胎移植入受體牛子宮內繁育，其中胚胎體外培養方法包括如下步驟：（1）以具有99.9%日本和牛遺傳性狀的公牛為父系，荷斯坦奶牛為母系，分別提取父系的精液和母系的卵母細胞；（2）在卵母細胞成熟液中培育卵母細胞；（3）將成熟的卵母細胞在體外受精培養液中進行體外受精；（4）將受精卵在胚胎培養液中培養；（5）體外胚胎的玻璃化冷凍。將體外培養的胚胎移植入受體牛子宮內，采用子宮雙側內壁胚胎移植法，最終培育出具有日本和牛和加拿大荷斯坦奶牛性狀的雜交子一代和牛新品系，其具有肉用價值高、生產性能好的特點。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及生物
，具體地，涉及。
技術介紹
日本和牛是日本神戶通過幾個世紀與外界隔絕，長期培育的肉牛品種。日本和牛是世界上公認的優秀肉牛品種，利用該品種所生產的牛肉品質也是獨一無二的，其特點為:質地柔軟、細嫩多汁，具有濃厚的牛肉風味，牛肉外觀表現出具有極強的大理石花紋，呈多星狀像雪花一樣均勻有致的分布在牛肉中，鮮嫩可口，富含鐵和不飽和脂肪酸，可顯著改善精力和耐力，并可延緩機體衰老。稱得上是牛肉產品中的極品。日本政府已經將日本和牛被視為國寶級的牛，日本政府于上世紀九十年代頒布禁令“禁止和牛及其遺傳物質的出口”，其中包括日本和牛活牛、精液、胚胎，使日本和牛作為世界最好遺傳肉牛品系在日本以外國家的發展得到限制。追溯北美地區創建純系日本和牛歷史知道，1976年由于當時日本政府與美國政府雙邊協議規定，日本政府以農業技術交流與科學發展研究為目的同意4頭日本和牛的公牛進口到美國；到在上世紀90年代又分別兩次引進了 200多頭公牛和母牛。由于日本政府采取嚴禁日本和牛遺傳物質出口，由于在上世紀日本和牛的這兩次引進，讓美國和加拿大抓住機遇，繁衍出純日本和牛品系，成為除日本外，真正擁有日本和牛品系的國家。美國和加拿大政府和相關組 織非常重視日本和牛的發展，制定出周密的日本和牛追蹤和評定方法。目前這些純系和牛的后代分布在美加為數不多的地區和農場，有著完整的系譜并可進行DNA親子鑒定的跟蹤。如今在北美日本和牛的基因相似純度達到99.9%以上，已經真正擁有除日本以外，擁有日本和牛品系的國家。然而，日本和牛雖然是世界上公認最好的肉牛之一，但是由于其體型小，出肉率低，后期育肥成本高等因素。除日本以外，日本和牛始終被排擠在主流世界肉牛行業之外。為了利用美國和加拿大的日本和牛資源，并且可以解決小型日本和牛的產肉量低和飼養成本高問題，又能確保日本和牛最顯著的富含大理石花紋肉質特性。通過分析美國加拿大盛產的各種牛品種，其中包括安格斯、海福特、夏洛萊、利木贊、西門塔爾和荷斯坦的肉質各項指標發現，雖然荷斯坦牛肉質等級低，但卻富含大理石花紋，是僅次日本和牛的牛品系。荷斯坦奶牛在美國和加拿大種群非常豐富，由于其產奶量高、牛奶品質高等特點，是世界行業公認具有世界最佳產奶基因種群。體外受精技術的開發與研究始于六十年代，在七十年代就有研究成果，在八十年代初體外胚胎研究從理論上、方法上得以充分的完善和迅速發展，成為動物胚胎工程及細胞工程領域內的一個基本和重要的研究分支。1982年美國科學家(Bracket等人)率先培育出世界第一胎體外受精牛犢，使家畜體外受精技術的研究取得了重大突破。日本科學家花田章等人(1985年)從屠宰母牛卵巢的卵母細胞，經人工成熟培養，體外受精及細胞培養成胚胎后移植于受體牛，在日本國家畜牧研究所成功地產下試管牛犢，真正開創體外胚胎生產技術運用的先河。以胚胎移植進行畜牧產品品種改良，是1964年世界首例牛非手術胚胎移植在日本國家畜牧研究所獲得成功和1974年英國科學家專利技術了胚胎冷凍方法之后，胚胎移植作為種畜品種改良和優良遺傳傳代手段才開始盛行于發達國家。關于胚胎玻璃化冷凍技術，1986年SchefTen等首先報道了利用25%甘油+25%1，2 —丙二醇玻璃化超快速冷凍牛桑堪胚一囊胚期胚胎。解凍后一步法脫除冷凍保護劑，獲得了 53%的移植妊娠率，降低了玻璃化溶液的毒性。利用玻璃化方法冷凍體外胚胎具有操作簡單、成本低、胚胎解凍后孵化率高等優點，而缺點是要求操作者具有能夠掌握該方法的技巧本領。
技術實現思路
本專利技術的目的在于提供。本專利技術是以加拿大荷斯坦奶牛為母系，利用加拿大屠宰場荷斯坦奶牛卵巢資源而抽取得到卵母細胞，以具有99.9%日本和牛遺傳性狀的種公牛為父系，獲取父系精液，通過體外胚胎培養方法培育出具有日本和牛與荷斯坦奶牛遺傳特性的雜交后代肉牛品系。本專利技術的日本和牛精液購自加拿大BC省本那比市精精遺傳公司(Jingjing Genetic Inc.；Burnaby, BC, Canada)。本專利技術提供的雜交和牛的培育方法包括雜交和牛胚胎的體外培養和胚胎移植入受體牛子宮內繁育兩個步驟。其中，雜交和牛胚胎體外培養方法包括如下步驟: I)以具有99.9%日本和牛遺傳性狀的公牛為父系，荷斯坦奶牛為母系，分別提取父系的精液和母系的卵母細胞；2)在卵母細胞成熟液中培育卵母細胞；3)將成熟的卵母細胞在體外受精培養液中進行受精；4)將受精卵在胚胎培養液中培養。本專利技術雜交和牛胚胎體外培養方法還包括步驟5)體外胚胎的玻璃化冷凍。該培養方法中步驟2)優選將清洗干凈的卵母細胞以100枚/管移入裝有2mL卵母細胞成熟液的錐形管中進行培養。該培養方法中所述步驟2)的卵母細胞成熟液的配制方法為:a)配制培養母液:氯化鈉5_7g，氯化鉀0.4-0.6g，磷酸二氫鉀0.1-0.3g，氯化鎂0.08-0.14g,乳酸鈉 0.4-0.6mL,葡萄糖 0.1-0.5g,碳酸氫鈉 l_4g,丙酮酸鈉 0.01-0.06g,氯化鈣0.1-0.5g，谷氨酰胺0.05-0.25g，加蒸餾水至IOOOmL,調節pH值為6.8，滅菌過濾得到培養母液；b)卵母細胞成熟液:培養母液中分別加入羥乙基哌嗪乙硫磺酸20_40mL，促卵泡素0.1-0.3mL，小牛血清白蛋白5-15g，酚紅0.01-0.02g，青霉素40-60IU，鏈霉素40-60IU，混勻后再加培養母液至IOOOmL,調節pH值為7.2。該培養方法中所述步驟2)的培養條件為5%C02，38.5_39°C，培養22_24h。該培養方法中所述步驟3)的體外受精包括:a)將精子數量約2000萬個的精液放入加有3mL體外受精培養液的離心管中，用離心機1500g轉速離心，用400mL體外受精培養液稀釋離心得到的精子；若為冷凍精液，操作方法為從液氮中取出一支冷凍精液細管(0.22cc，其中精子數量約2000萬個)在30°C水浴中解凍10秒后，用消毒剪刀剪開后，將細管中的精液放入加有3mL體外受精培養液的離心管中，用離心機1500g轉速離心，用400mL體外受精培養液稀釋離心得到的精子；b)將成熟的卵母細胞以100枚/孔移入含體外受精培養液的受精盤中，加入稀釋后的精子液，使每孔精子密度為1-2 X IO6個/mL。該培養方法中所述步驟3)的體外受精培養液的配制方法為:a)配制培養母液:氯化鈉5_7g，氯化鉀0.4-0.6g，磷酸二氫鉀0.1-0.3g，氯化鎂0.08-0.14g,乳酸鈉 0.4-0.6mL,葡萄糖 0.1-0.5g,碳酸氫鈉 l_4g,丙酮酸鈉 0.01-0.06g,氯化鈣0.1-0.5g，谷氨酰胺0.05-0.25g，加蒸餾水至IOOOmL,調節pH值為6.8，滅菌過濾得到培養母液；b)體外受精培養液:培養母液中加入羥乙基哌嗪乙硫磺酸40_60mL，肝素0.4-0.8mL，果糖0.8-1.5g，乳酸5_15mL，小牛血清白蛋白5_8g，酚紅0.01-0.02g，青霉素40-60IU，鏈霉素40-60IU，混勻后再加培養母液至IOOOmL,調節pH值為7.2。該培養方法中所述步驟3)的培養條件為5%C02，38.5_39°C，培養20_22h。該培養方法中所述步驟4)的胚胎培養液的配制方法為:a)配制培養母液:氯本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種雜交和牛胚胎體外培養方法，包括如下步驟：1）以具有99.9%日本和牛遺傳性狀的公牛為父系，荷斯坦奶牛為母系，分別提取父系的精液和母系的卵母細胞；2）在卵母細胞成熟液中培育卵母細胞；3）將成熟的卵母細胞在體外受精培養液中進行受精；4）將受精卵在胚胎培養液中培養。

【技術特征摘要】
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【專利技術屬性】
技術研發人員：祝加貝，
申請(專利權)人：北京富通華生物科技有限公司，
類型：發明
國別省市：