一種基于Fe3O4納米粒子間接富集免疫磁分離的食源性致病菌快速檢測方法技術

一種基于Fe3O4納米粒子間接富集免疫磁分離的食源性致病菌快速檢測方法，屬于食品安全致病菌快速檢測技術領域。本發明專利技術依賴于建立的可以用于食品液體樣本中致病菌的檢測方法，利用1抗特異性結合目標菌，利用Fe3O4納米粒子材料制備2抗免疫磁珠針對性地富集1抗標記的目標菌株，通過分離捕獲了目標菌的納米磁珠，再硝化反應使之轉化為鐵離子，檢驗鐵離子從而間接檢測出樣本中是否含有目標致病菌。在一定條件下鐵離子的量與目標菌顯示出線性關系，在一定范圍能夠定量檢測目標菌。該方法可以用于食品樣本中有害致病菌的快速檢測，從而可以作為大批待檢樣品的快速篩選。

【技術實現步驟摘要】

本專利技術涉及一種致病菌的快速檢測方，尤其涉及一種基于Fe3O4納米粒子間接富集免疫磁分離的食源性致病菌快速檢測方法。
技術介紹
基本原理:單克隆抗體或抗原分子與酶分子通過共價鍵結合，這種結合不會改變單克隆抗體、抗原和酶的免疫學特性及生物活性，特異性的單克隆抗體只會與特異性的抗原結合。其主要的原理步驟:1.向待檢樣本中加入目標菌的第I抗體，若存在目標菌，則與I抗結合形成I抗復合物；2.利用磁性Fe3O4納米粒子，通過修飾抗體實現表面功能化，將I抗的抗體即2抗偶聯在磁珠表面，形成特異性免疫磁珠，并將多余活性位點封閉。2.將另一部分目標菌的特異性I抗單克隆抗體采用一定的方法固定在固相載體表面，并將多余活性位點封閉。3.將第2步制備的2抗特異性免疫磁珠加入到第I步的待檢樣本中，用于抓取富集目標菌，通過外加磁場將磁珠分離出來，此時，結合了目標菌的I抗復合物和沒有結合目標菌的過量I抗都會與磁珠表面的2抗結合,還是混在一起。4.將上述混在一起的磁珠，加到第2步的固相載體表面，則抓取了目標菌的磁珠將與固相載體表面I抗發生特異性結合，形成雙抗夾心，用無菌的去離子水清洗可以將未發生結合的磁珠洗脫。5.再采用洗脫劑將固定載體上的結合的特異性納米免疫磁珠洗下來，磁分離清洗掉離子、溶劑。此部分磁珠如果存在，就是抓取了目標菌的磁珠。6.加入硝酸和硫酸(王水)進行硝化反應，這部分磁珠如果存在，則Fe3O4轉化為三價鐵離子和二價鐵離子。所有食品標準中致病菌都是不得檢出的。通過檢測是否存在鐵離子就可以檢測出樣本中是否存在目標菌。通過加標，在一定范圍內可以定量檢測目標菌。該方法中Fe3O4磁珠既是分離富集的手段，同時也是定量檢測的載體，起了一個信號放大的作用。該方法的主要優點就是快速、靈敏度相對較高。相對于致病菌的微生物培養2-3天甚至幾天的時間。此方法主要取決于樣品的預處理時間。因此，用該方法可做大規模待檢樣本的陽性篩選，檢出的陽性樣還需用微生物培養進行確證。目前，國內外還沒有文獻報道這種方法，但是采用免疫磁珠進行致病菌的富集、目標物的富集等的報道還是很多的，但沒有采用檢驗鐵離子的方法做進一步的檢測。
技術實現思路
本專利技術的目的是提供一種基于Fe3O4納米粒子間接富集免疫磁分離的食源性致病菌快速檢測方法，用于對各種不同的食品樣品進行評價，該方法是一種客觀有效的檢出食品中有害致病菌的方法，從而在某種程度上大大縮減了食品樣品有害致病菌的篩選時間。—種基于Fe3O4納米粒子間接富集的免疫磁分離食源性致病菌快速檢測方法，通過間接富集、分離捕獲的免疫磁珠，使其轉化為鐵離子，提出鐵離子與目標菌的相關性指標，通過檢測鐵離子來間接定量目標菌。不同的致病菌檢出下限不同。該方法依賴于建立的可用于食品樣品中有害致病菌特征性免疫磁珠富集、分離。采用偶聯了特異性單克隆抗體的免疫磁珠，可以將樣品中的特異性致病菌進行富集；通過設計雙抗夾心分離捕獲到目標菌的磁珠，再將磁珠硝化反應轉化為三價鐵離子和二價鐵離子。采用鄰二氮菲吸光光度法、硫氰酸鉀比色法等可以檢測出鐵離子的量，從而可以算出磁珠的量，通過加標定量磁珠而在一定程度間接定量出目標菌的量。通過定量分析捕獲目標菌的磁珠含量，從而可以間接定量出食品樣品中的有害致病菌含量。檢測出的致病菌含量與磁珠含量線性相關，擬合度較好。最終以免疫磁珠與致病菌間的對應關系為紐帶，確定食品樣本中的致病菌菌落數。本專利技術是這樣實現的，步驟如下: O向待檢樣本中加入目標菌的第I抗體，若存在目標菌，則與I抗結合形成I抗復合物； 2)2抗即第I抗體的抗體免疫磁珠的制備； 3)將目標菌特異性I抗單克隆抗體固定在固相載體表面； 4)免疫磁珠富集目標菌株，并分離:將第2步制得的2抗免疫磁珠加入第I步的待檢樣品，充分混合震蕩，抓取目標菌后通過施加外加磁場，則磁珠就匯集到磁場一邊，吸走上清液則可以分離出磁珠若待檢樣本中有目標菌，則被磁珠所富集，加少量無菌的去離子水則形成目標菌的磁珠懸濁液；此時，結合了目標菌的I抗復合物和沒有結合目標菌的過量I抗都會與磁珠表面的2抗結合,還是混在一起。4)將富集的磁珠懸濁液加到第3步制作的固定了 I抗單克隆抗體的固相載體上，若存在目標菌則形成雙抗夾心；用無菌的去離子水清洗，則沒有抓取到目標菌的磁珠就被洗掉，若不存在目標菌，則所有磁珠都被洗掉； 5)之后，用洗脫劑將固定板上的雙抗夾心的磁珠洗下來，用外加磁場分離磁珠的方法用無菌的去離子水清洗掉離子和溶劑，如果還存在磁珠就是抓到目標菌的磁珠； 6)加入硝酸和硫酸(王水)進行硝化反應，這部分磁珠如果存在，則被反應轉化為三價鐵離子和二價鐵離子。所有食品標準，致病菌均不得檢出，此時若檢出了鐵離子就間接檢出了目標致病菌。將過量的酸中和后，采用鄰二氮菲吸光光度法、硫氰酸鉀比色法等可以檢測出鐵離子的量，從而可以算出磁珠的量，通過加標定量磁珠而在一定程度間接定量出目標菌的量。所述納米免疫磁珠核材Fe3O4材料，納米粒徑小于1000納米。所述的目標菌的最終檢出評價方法是基于是否檢出鐵離子及鐵離子的濃度。本專利技術的有益效果:本專利技術提供一種客觀的快速檢測出食品中的有害致病菌的方法，其特征是通過檢驗鐵離子間接檢出目標致病菌。該方法可以客觀有效地對食品中有害致病菌進行檢測，相比于致病菌的生物培養確認，該方法具有快速檢測的優勢，可以用于大規模樣本的快速篩選。一定程度上可以定量檢測。具體實施例方式實例I 檢驗食品樣本中測定其是否含有有害致病菌——李斯特菌。1.1.2抗免疫磁珠制備:1抗米用李斯特囷的兔抗IgG單克隆抗體，2抗為李斯特菌的羊抗兔IgG，可以是單抗也可以是多抗。2抗免疫磁珠制備:磁珠與單克隆抗體的偶聯。采用商品化的奧潤公司的羧基化磁珠，PM3-020(180nm)與2抗偶聯。偶聯步驟:①清洗:分別取5mg羧基化磁珠于5mL離心管中，2mL PB (0.02M, pH=6.0)洗2次，洗滌后用2mL MES(0.05M，pH=6.0)重懸；②活化:超聲使磁珠分散，再分別加入Img EDC, Img NHSS(用0.05M,pH=6.0 MES溶解)，25°C活化2h，旋轉儀15r/min保持懸浮狀態；③偶聯:磁分離，吸去上清，2mL PB (0.0211，？!1=7.4)洗滌一次并轉移至新的離心管，31^ PB ((λ 02M，ρΗ=7.4)重懸，超聲使磁珠分散。再分別將275 μ g第2抗體羊抗兔IgG加入到已活化磁珠中，25°C偶聯3h，旋轉儀15r/min保持懸浮狀態；④封閉:磁分離，取出上清(上清中的蛋白含量待檢)，加入lmg/mL乙醇胺及lmg/mL BSA封閉(0.02M, pH=7.4的PB溶解，并調節pH至中性)，25°C封閉2h，旋轉儀15r/min保持懸浮狀態；⑤保存:0.0lM PBS洗滌磁珠2次，磁分離，去上清，用3mL pH7.4 PB (0.02M,0.02% NaN3，0.5%BSA)重懸，存于 4°C。制備的免疫磁珠備用。2.2.1抗單克隆抗體固定:可以采用常規的酶標板固定方法，也可以采用以下方法。用干凈的蓋玻片5X5mm2正方形,鍍膜機先噴一層Cr (2-4 nm)用以幫助固定金。再用在表面濺射噴上一層納米金，再采用200微升2 mmol 二硫本文檔來自技高網...

【技術保護點】
一種基于Fe3O4納米粒子間接富集免疫磁分離的食源性致病菌快速檢測方法，其特征步驟如下：1）將檢測目標菌與目標菌的1抗結合形成1抗復合物；2）檢測目標菌的1抗抗體，即2抗特異性免疫磁珠的制備；3）將目標菌1抗特異性單克隆抗體在固相載體上的固定；4）免疫磁珠富集目標菌株，并分離：將第2步制得的2抗免疫磁珠加入到第1步結合了1抗的待檢樣品，充分混合震蕩，抓取目標菌后通過施加外加磁場，則磁珠就匯集到磁場一邊，吸走上清液則可以分離出磁珠，若待檢樣本中有目標菌，目標菌首先與1抗結合形成復合物，在加入2抗磁珠后，通過2抗與1抗的相互作用，從而捕獲1抗復合物，被磁珠所富集，加少量無菌的去離子水則形成目標菌的磁珠懸濁液；4）將富集的磁珠懸濁液加到第3步固定了1抗的單克隆抗體的固相載體上，若存在目標菌則形成雙抗夾心，用無菌的去離子水清洗，則沒有抓取到目標菌的磁珠就被洗掉，若不存在目標菌，則所有磁珠都被洗掉；5）之后，用洗脫劑將固定板上的雙抗夾心的磁珠洗下來，用外加磁場分離磁珠的方法用無菌的去離子水清洗掉離子和溶劑，如果還存在磁珠就是抓到目標菌的磁珠；6）這部分磁珠，加入分析純的硝酸和硫酸（王水）進行硝化反應，使磁珠Fe3O4轉變為三價鐵離子和二價鐵離子，中和過量酸后采用鄰二氮菲吸光光度法或硫氰酸鉀比色法等可以檢測出鐵離子的量，從而可以算出磁珠的量，通過加標定量磁珠而在一定程度間接定量出目標菌的量。...

【技術特征摘要】

【專利技術屬性】
技術研發人員：張錦勝，唐群，賴衛華，
申請(專利權)人：南昌大學，
類型：發明
國別省市：