本發明專利技術公開了一種人口腔鱗癌CAL-27耐藥細胞株的培養方法及所得的細胞株。該方法包括：（1）在細胞培養皿中種植CAL-27親本細胞，細胞長至貼壁后待融合率達到30～40%時加入篩選藥物，初始濃度采用該藥物的IC20值，連續作用24～72小時后洗去死細胞并擴增存活的細胞；（2）待細胞重新處于對數生長期時，重復（1）中所述洗去死細胞并擴增存活的細胞的操作，并將篩選藥物的濃度提高一倍作用，在篩選藥物的濃度提高至第一定值時，降低藥物濃度增加倍數，在篩選藥物的濃度加至第二定值時，將細胞經過凍存后復蘇細胞，即得。所述的耐藥細胞株具有臨床上的人口腔鱗癌的生物學性狀，是研究人口腔鱗癌細胞的耐藥機制的理想模型。
Method for culturing human oral squamous cell carcinoma CAL-27 cell line and culture cell line
The invention discloses a method for culturing human oral squamous cell carcinoma CAL-27 cell line and a cell line. The method comprises the following steps: (1) in CAL-27 cells grown in cell culture dish, cells adherent to long after the fusion rate was 30 ~ 40% with drug screening, initial concentration of the drug IC20, for 24 to 72 hours after the wash away dead cells and amplified the survival cells; (2) to be cells in the logarithmic growth phase, repeat (1) in the wash away dead cells and amplification of cell survival and drug screening operation, the concentration is doubled, in enhancing the concentration of drug screening to a certain value, reduce the increase of drug concentration in multiple drug screening concentration increased to second set when the cells after frozen thawed cells, i.e.. The drug resistant cell line has the biological characteristics of human oral squamous cell carcinoma, and is an ideal model for studying the mechanism of human oral squamous cell carcinoma.
【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于生物
，特別涉及一種人口腔鱗癌CAL-27耐藥細胞株的培養方法及培養所得的細胞株。
技術介紹
在我國，口腔頜面部的惡性腫瘤以癌為最常見，肉瘤較少。在癌瘤中又以鱗狀細胞癌為最多見，一般占80%以上；其次為腺性上皮癌(如黏液表皮樣癌、腺癌、腺樣囊性癌、惡性多形性腺瘤、腺泡細胞癌等)及未分化癌。鱗狀細胞癌常向區域淋巴結轉移，晚期可發生遠處轉移。針對鱗狀細胞癌，雖然目前已經開發出了很多的治療藥物并且已經被有效應用于臨床上，然而，在眾多的化療過程中經常遇到耐藥和多藥聯用耐藥的情況。耐藥性一般由眾多因素導致，其中不容忽視的是個體化基因的差異，差異基因的篩查與深入的耐藥分子機制研究對未來的臨床治療有很深遠的意義。傳統誘導與篩選的方法建立的口腔鱗癌細胞株由于大劑量給藥對細胞狀態影響較大，造成差異基因的人為改變，不利于后期篩查。
技術實現思路
本專利技術所要解決的技術問題是為了克服目前常規方法篩選得到的人口腔鱗癌耐藥細胞株容易因人為因素造成基因改變的缺陷，而利用人口腔鱗癌CAL-27細胞作為親本細胞，選用臨床常用腫瘤化療藥物作為篩選藥物，在體外模擬人體體內給藥后藥物的真實作用過程，從而建立起一套穩定有效的耐藥細胞株篩選體系和方法。本專利技術提供的技術方案之一是:一種人口腔鱗癌CAL-27耐藥細胞株的培養方法，其包括如下步驟:(I)在細胞培養皿中種植人口腔鱗癌CAL-27親本細胞，細胞長至貼壁后待融合率達到30 40%時加入篩選藥物，初始濃度采用該藥物的IC2tl值，連續作用24 72小時后洗去死細胞并擴增存活的細胞；(2)待細胞重新處于對數生長期時，將細胞重復步驟(I)中所述洗去死細胞并擴增存活的細胞的操作，并將篩選藥物的濃度提高一倍進行作用，在篩選藥物的濃度提高至第一定值時，降低藥物濃度增加倍數，在篩選藥物的濃度加至第二定值時，將細胞經過凍存后復蘇細胞，即制得人口腔鱗癌CAL-27耐藥細胞株；所述第一定值的判斷標準是指到該第一定值的下一個倍增值時，觀察到細胞大量死亡，細胞狀態變差，所述第二定值的判斷標準是細胞在該第二定值的反復作用下能夠正常生長，到該第二定值下一個倍增值時細胞增殖不受影響，細胞生長正常。本專利技術中，步驟(I)較佳地在細胞長至貼壁后待融合率達到35 40%時加入篩選藥物；步驟(I)較佳地在連續作用36 48小時后洗去死細胞并擴增存活的細胞；所述的篩選藥物為臨床上常用的腫瘤化療藥物，較佳地選自5 -氟尿嘧啶(5-Fu)、順鉬(CDDP)和羥基喜樹堿(HCPT)中的任一種；所述的藥物的IC2tl值為臨床上常規的概念，指誘導腫瘤細胞凋亡20%時該藥物的濃度。本專利技術中，步驟(2)所述將細胞經過凍存后復蘇細胞的操作較佳地為在細胞生長良好，細胞對藥物耐受增加，基本不出現凋亡時，將細胞凍存3個月后復蘇細胞。本專利技術中，較佳地，在步驟(I)之前還包括如下步驟:(a)取生長狀態良好、處于對數生長期的人口腔鱗癌CAL-27細胞，用胰酶消化計數；(b)在細胞培養容器中種植8組細胞，每組3個重復樣品，每個樣品加入細胞數為8000個，待細胞生長至貼壁；(C)在含10%FBS的高糖DMEM完全培養基中添加步驟(I)所述篩選藥物形成濃度梯度，并加入對應組別的樣品細胞中，使該篩選藥物對細胞發揮作用，待藥物作用48小時后，加入MTT孵育4小時，然后加入三聯溶解液(10% SDS，5%異丁醇，0.01mol/L HCl)溶解，取樣于0D595nm檢測讀值，計算IC5tl濃度，并根據IC5tl濃度的值計算該篩選藥物的IC2tl濃度。 本專利技術中，步驟(a)所述用胰酶消化計數的操作中，所取的CAL-27細胞的數量與所用的胰酶數量之間的比例為本領域常規，只要胰酶能將待消化的細胞全部覆蓋浸潤即可；優選地，所取的CAL-27細胞的數量與所用的胰酶數量之間的比例為:每3X106個細胞用lmllOmol/ml的胰酶消化。本專利技術中，步驟(b)所述的細胞培養容器為本領域常規，優選96孔板。本專利技術中，優選地，步驟(c )所述的篩選藥物為5-氟尿嘧啶(5-Fu )、順鉬(⑶DP )和羥基喜樹堿(HCPT )中的任一種。本專利技術中，優選地，步驟(c)所述的濃度梯度包括如下濃度:0yg/ml、0.02yg/ml、0.04 μ g/ml、0.08 μ g/ml、0.16 μ g/ml、0.32 μ g/ml、0.64 μ g/ml、1.28 μ g/ml。本專利技術中，優選地，步驟(C)所述的計算IC5tl濃度的方法采用《定量藥理學》(孫瑞元著，人民衛生出版社出版，1987)中所述的改良寇氏法，所述的改良寇氏法如表I所示:表權利要求1.一種人口腔鱗癌CAL-27耐藥細胞株的培養方法，其特征在于，其包括如下步驟: (1)在細胞培養皿中種植人口腔鱗癌CAL-27親本細胞，細胞長至貼壁后待融合率達到30 40%時加入篩選藥物，初始濃度采用該藥物的IC2tl值，連續作用24 72小時后洗去死細胞并擴增存活的細胞； (2)待細胞重新處于對數生長期時，將細胞重復步驟(I)中所述洗去死細胞并擴增存活的細胞的操作，并將篩選藥物的濃度提高一倍進行作用，在篩選藥物的濃度提高至第一定值時，降低藥物濃度增加倍數，在篩選藥物的濃度加至第二定值時，將細胞經過凍存后復蘇細胞，即制得人口腔鱗癌CAL-27耐藥細胞株；所述第一定值的判斷標準是指到該第一定值的下一個倍增值時，觀察到細胞大量死亡，細胞狀態變差，所述第二定值的判斷標準是細胞在該第二定值的反復作用下能夠正常生長，到該第二定值下一個倍增值時細胞增殖不受影響，細胞生長正常。2.一種人口腔鱗癌CAL-27耐藥細胞株，其特征在于，其是保藏號為CCTCC NO:C2012149的人口腔鱗癌CAL-27-5-Fu耐藥細胞株。3.如權利要求2所述的人口腔鱗癌CAL-27-5-FU耐藥細胞株的子代細胞。4.如權利要求2所述的人口腔鱗癌CAL-27-5-FU耐藥細胞株在制備于哺乳動物中產生鱗狀細胞癌的試劑中的用途。5.一種人口腔鱗癌CAL-27耐藥細胞株，其特征在于，其是保藏號為CCTCC NO:C2012150的人口腔鱗癌CAL-27-CDDP耐藥細胞株。6.如權利要求5所述的人口腔鱗癌CAL-27-CDDP耐藥細胞株的子代細胞。7.如權利要求5所述的人口腔鱗癌CAL-27-CDDP耐藥細胞株在制備于哺乳動物中產生鱗狀細胞癌的試劑中的用途。8.一種人口腔鱗癌CAL-27耐藥細胞株，其特征在于，其是保藏號為CCTCC NO:C2012151的人口腔鱗癌CAL-27-HCPT耐藥細胞株。9.如權利要求8所述的人口腔鱗癌CAL-27-HCPT耐藥細胞株的子代細胞。10.如權利要求8所述的人口腔鱗癌CAL-27-HCPT耐藥細胞株在制備于哺乳動物中產生鱗狀細胞癌的試劑中的用途。全文摘要本專利技術公開了一種人口腔鱗癌CAL-27耐藥細胞株的培養方法及所得的細胞株。該方法包括(1)在細胞培養皿中種植CAL-27親本細胞，細胞長至貼壁后待融合率達到30～40%時加入篩選藥物，初始濃度采用該藥物的IC20值，連續作用24～72小時后洗去死細胞并擴增存活的細胞；(2)待細胞重新處于對數生長期時，重復(1)中所述洗去死細胞并擴增存活的細胞的操作，并將篩選藥物的濃度提高本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種人口腔鱗癌CAL?27耐藥細胞株的培養方法，其特征在于，其包括如下步驟：?（1）在細胞培養皿中種植人口腔鱗癌CAL?27親本細胞，細胞長至貼壁后待融合率達到30～40%時加入篩選藥物，初始濃度采用該藥物的IC20值，連續作用24～72小時后洗去死細胞并擴增存活的細胞；?（2）待細胞重新處于對數生長期時，將細胞重復步驟（1）中所述洗去死細胞并擴增存活的細胞的操作，并將篩選藥物的濃度提高一倍進行作用，在篩選藥物的濃度提高至第一定值時，降低藥物濃度增加倍數，在篩選藥物的濃度加至第二定值時，將細胞經過凍存后復蘇細胞，即制得人口腔鱗癌CAL?27耐藥細胞株；所述第一定值的判斷標準是指到該第一定值的下一個倍增值時，觀察到細胞大量死亡，細胞狀態變差，所述第二定值的判斷標準是細胞在該第二定值的反復作用下能夠正常生長，到該第二定值下一個倍增值時細胞增殖不受影響，細胞生長正常。
【技術特征摘要】
【專利技術屬性】
技術研發人員：王海峰，姚遠颋，費倩嵐，談竹君，勞昕元，
申請(專利權)人：上海黃離生物科技有限公司，
類型：發明
國別省市：
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