本發明專利技術公開了一種植物樣品中內源性油菜素甾醇的樣品前處理方法。該方法先以溶劑提取內源性油菜素甾醇，然后以硼親和材料為萃取介質對上一步所得溶液進一步除雜，進而實現內源性油菜素甾醇的樣品前處理。該方法簡單、快速、省溶劑、易操作。此外，方法在去除植物提取液內源性雜質方面表現出高選擇性，可實現低含量的內源性油菜素甾醇的富集純化。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及一種植物樣品中內源性油菜素留醇的樣品前處理方法，屬于分析化學領域。
技術介紹
油菜素甾醇(brassinosteroids, BRs)是一類多輕基化的甾醇類化合物,在植物體內含量極低，但調控著植物的一系列生理學和代謝過程。近年來，關于油菜素留醇的生理學機能，例如BRs的生物合成，降解以及代謝路徑的研究收到廣泛關注。但由于植物提取液中基質復雜且油菜素留醇含量極低，這些研究的開展受到一定限制。因此，建立高效的樣品前處理方法并結合靈敏的檢測手段是內源性BRs檢測的關鍵。目前已報道的植物中油菜素甾醇的前處理方法包括液液萃取、固相萃取、固相微萃取、磁固相萃取和液相色譜純化方法等。這些方法多數要求幾十克鮮重植物組織，如此大的樣品量對于部分珍貴的樣品難以實現，同時也給前處理過程帶來溶劑消耗大和成本高等問題。此外，上述前處理方法僅僅通過BR和雜質的疏水性差異實現除雜，會不可避免地造成雜質與BRs的共洗脫，必然為后續的液相分離帶來負擔，從而降低BRs的質譜離子化效率。
技術實現思路
本專利技術所要解決的技術問題是對現有的油菜素留醇前處理方法進行改進，提供一種高選擇性且簡便快速的植物樣品前處理方法，并實現內源性油菜素留醇的樣品前處理。本專利技術解決上述問題而采用的技術方案是:，包括以下步驟:1-1準確稱量植物樣品后將其置于研缽中，液氮冷凍研磨至粉末狀后，加入同位素內標油菜素內酯和油菜素留酮，然后加入溶劑提取，靜置，離心取上清液，得到未除雜的樣品溶液；2-1去除上一步得到的樣品溶液中的溶劑，以緩沖溶液溶解樣品溶液，用活化后的硼親和材料萃取樣品溶液，清洗硼親和材料，再以解吸液解吸硼親和材料上的油菜素甾醇，收集解吸液，去除解吸液中的有機溶劑，進而實現內源性油菜素留醇的樣品前處理。所述步驟2-1中，硼親和材料依次以能夠與水互溶的有機溶劑和緩沖溶液活化。本專利技術步驟1-1與2-1之間插入有下列步驟1-2:1-2對步驟1-1得到的樣品溶液除水；以活化后的材料萃取步驟1-2除水后的樣品溶液，解吸、收集并合并上樣流出液和解吸液，得到初步除雜后的樣品溶液。樣品中的水分會對后續除雜過程產生不利影響，因此，除水步驟很重要。本專利技術所指的除水過程包括化學除水法和物理除水法?；瘜W除水法，其特征在于，使用化學試劑消耗體系內的水分；物理除水法，其特征在于使用物理手段將體系內的水分揮干，包括凍干，氮氣吹干等方法。植物組織提取溶劑的作用是:在有效地提取出分析物的前提下，盡可能少地提取雜質等干擾物。所述步驟1-1中提取所用的溶劑為甲醇、乙腈、異丙醇、氯仿、二氯甲烷、乙酸乙酯、正己烷、乙醚、丙酮或甲酸中的一種或幾種。所述步驟2-1中的硼親和材料為含有硼酸基團的硅膠顆粒、磁性材料、無定型材料、凝膠、填充柱或整體柱中的一種。所述的初步除雜是指初步除去提取液中含有的大量色素、脂質和親水雜質。因此，本專利技術步驟1-2中所用的材料是采用由碳材料、親水材料、疏水材料通過C31, Cf或者C33方式組合以化學或物理方式構建的硅膠顆粒、磁性材料、無定型材料、凝膠、填充柱或整體柱均可以達到初步除雜的目的。硼親和色譜是選擇性捕獲分離含順式羥基化合物的有效手段，已被成功用于糖蛋白、RNA和糖類的富集分離。在堿性環境中，硼酸可與順式二醇形成穩定的五元或六元環狀硼酸酯，在酸性條件下，順式二醇類物質又能通過開環而被釋放。BRs在C2，C3和C22，C23位上的兩對順式羥基使得油菜素留醇十分適合硼親和萃取。本專利技術所述的硼親和除雜是指，由含硼酸基團的硅膠顆粒、磁性材料、無定型材料、凝膠、填充柱或整體柱實現對油菜素甾醇的萃取。檢測油菜素甾醇的儀器是指，液相色譜-光學檢測器、液相色譜-質譜儀聯用、毛細管電泳-光學檢測器聯用，或者毛細管電泳-質譜儀聯用。本專利技術方法簡單、快速、省溶劑、易操作。此外，方法在去除植物提取液內源性雜質方面表現出高選擇性，可實現低含量的內源性油菜素留醇的富集純化。附圖說明圖1為本專利技術方法與文獻報道方法的總離子流對比圖，其中，A是植物樣品以文獻法所得的總離子流圖，B是以本專利技術法處理后的總離子流色譜圖，C是標準樣品以硼親和萃取法處理后的總離子流色譜圖。圖2為本專利技術法檢測到的內源性油菜素甾醇的多反應監控色譜圖。其中A是水稻裕泰A葉樣品；B是水稻裕泰B葉樣品；C是油菜葉樣品；D1 D4是油菜花的花苞樣品；E1 E3 是油菜花的樣品。I 為 28-norbrassinolide, 2 為 28_norcastasterone, 3 為brassinolide, 4 為 castasterone。具體實施例方式下面結合具體實施例對本專利技術的內容做詳細說明。實施例1準確稱取Ig植物組織，液氮研磨至粉末狀，轉移至IOmL離心管中，加入同位素內標油菜素內酯和油菜素甾酮各2ng，放置片刻后，加入5mL乙腈混合均勻。放入_18°C的冰箱內提取12小時。離心取上清液，向上清液中加入0.5克氯化鈉促使溶液分層，棄去水相。再加入0.5克無水硫酸鎂除去剩余水分。離心取除水后的上清液，棄去不溶物。將上清液通過預先活化的石墨化炭黑/乙二胺-N-丙基鍵合硅膠雙層固相萃取，以甲醇/乙腈(l/l，v/v，2mL)解吸；收集上樣流出液和解吸液并吹干。以緩沖溶液(磷酸緩沖溶液，20mM，pH9.0, ImL)溶解吹干的樣品殘渣，將該溶液通過預先活化的硼親和固相微萃取整體柱，以緩沖溶液(磷酸緩沖溶液，20mM，pH9.0, ImL)清洗整體柱，最后以含3%雙氧水的解吸液(H2O/乙腈，l/9，v/v，ImL)解吸，收集解吸液并吹干其中的有機溶劑。最終，將樣品溶液定容至100微升，其中80微升進入高效液相色譜-電噴霧-三重四級桿串聯質譜分析。將上述方法與文獻報道方法的總離子流對比，如圖1所示。與文獻法相比，本方法可大大降低樣品的基質，其基質與標準品類似，表明本專利技術具有良好的選擇性除雜效果。本專利技術法檢測到的幾種內源性油菜素甾醇:28-降油菜素內酯(28-norbrassinolide), 28-降油菜素甾麗(28-norcastasterone)，油菜素內酷(brassinolide)，油菜素留麗(castasterone)的多反應監控色譜圖如圖2所示。五種植物樣品中內源性油菜素留醇檢測結果如表I所示。表1.五種實際樣品中內源性油菜素甾醇的含量權利要求1.一種植物樣品中內源性油菜素留醇的樣品前處理方法，其特征在于，包括以下步驟: 1-1準確稱量植物樣品后將其置于研缽中，液氮冷凍研磨至粉末狀后，加入同位素內標油菜素內酯和油菜素留酮，然后加入溶劑提取，靜置，離心取上清液，得到未除雜的樣品溶液； 2-1去除上一步得到的樣品溶液中的溶劑，以緩沖溶液溶解樣品溶液，用活化后的硼親和材料萃取樣品溶液，清洗硼親和材料，再以解吸液解吸硼親和材料上的油菜素留醇，收集解吸液，去除解吸液中的有機溶劑，進而實現內源性油菜素留醇的樣品前處理。2.根據權利要求1所述的一種植物樣品中內源性油菜素留醇的樣品前處理方法，其特征在于，所述步驟2-1中，硼親和材料依次以能夠與水互溶的有機溶劑和緩沖溶液活化。3.根據權利要求1所述的一種植物樣品中內源性油菜素留醇的樣品前處理方法，其特征在于，步驟1-1與2-1之間插入有下列步驟1-2: 1-2對步驟本文檔來自技高網...
【技術保護點】
一種植物樣品中內源性油菜素甾醇的樣品前處理方法，其特征在于，包括以下步驟：1?1準確稱量植物樣品后將其置于研缽中，液氮冷凍研磨至粉末狀后，加入同位素內標[2H3]油菜素內酯和[2H3]油菜素甾酮，然后加入溶劑提取，靜置，離心取上清液，得到未除雜的樣品溶液；2?1去除上一步得到的樣品溶液中的溶劑，以緩沖溶液溶解樣品溶液，用活化后的硼親和材料萃取樣品溶液，清洗硼親和材料，再以解吸液解吸硼親和材料上的油菜素甾醇，收集解吸液，去除解吸液中的有機溶劑，進而實現內源性油菜素甾醇的樣品前處理。
【技術特征摘要】
【專利技術屬性】
技術研發人員：馮鈺锜，丁俊，毛利菁，
申請(專利權)人：武漢大學，
類型：發明
國別省市：
還沒有人留言評論。發表了對其他瀏覽者有用的留言會獲得科技券。