高純度肝素及其制備方法技術(shù)

本發(fā)明專利技術(shù)提供作為藥品、化妝品、研究試劑等有用的高純度肝素及其制備方法，更具體而言，涉及實質(zhì)上不含抗亞硝酸分解的雜質(zhì)的肝素，以及如下所述的肝素的制備方法：向5~30重量%的肝素水溶液中混合0.2~1倍量（體積）的乙醇，得到肝素的膠體狀沉淀物。

【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】
【國外來華專利技術(shù)】
本專利申請要求日本專利申請第2010-205310號的優(yōu)先權(quán)，在此將其全部內(nèi)容引述至本說明書中作為參考。本專利技術(shù)涉及實質(zhì)上不含引起副作用的物質(zhì)、安全性高、作為藥品、化妝品及研究試劑等有用的。
技術(shù)介紹
肝素是存在于肝、小腸、肺和皮膚等的、含有經(jīng)硫酸化的D-葡糖胺、D-葡糖醛酸、L-艾杜糖醛酸等的酸性粘多糖。肝素具有較強的抗凝血活性，除應(yīng)用于彌散性血管內(nèi)凝血(DIC)的治療、各種血栓栓塞癥(靜脈血栓栓塞癥、心肌梗塞、肺栓塞、腦栓塞、四肢動脈血栓栓塞、手術(shù)中、手術(shù)后的血栓栓塞等)的治療及預(yù)防外，還可在使用血液透析、人工心肺機等體外循環(huán)裝置時或插入血管導(dǎo)管時，或是在輸血及血液檢查等場合下用來防止血液凝固。此外，公知肝素除了具有抗凝血活性外，還具有脂蛋白脂肪酶活化作用、抗血小板凝集作用、降血壓作用、抗補體作用、抑制癌癥轉(zhuǎn)移作用、抑制肥大細胞脫顆粒的作用、抑制局部炎癥、鎮(zhèn)痛以及促進肌肉組織的血液循環(huán)等多種生理活性。肝素主要是從健康的供食用動物的組織中提取/分級來制造的，但從BSE(牛海綿狀腦病)問題出現(xiàn)后，作為藥物的肝素的來源則基本為豬的小腸粘膜。通常，將豬小腸粘膜懸浮于水類溶劑中進行蛋白質(zhì)消化，然后加入吸附劑等(非專利文獻1)，以復(fù)合物的形式將肝素及其他粘多糖(主要是硫酸軟骨素系列、硫酸乙酰肝素等)提取，將其作為粗原料。接著再對其進行批量混合/分級，得到肝素(所謂的“未分級肝素”)。用上述方法所得到的肝素(未分級肝素)含有除肝素外的粘多糖(主要是硫酸乙酰肝素、硫酸軟骨素B及硫酸軟骨素C)，已經(jīng)知道其含量會隨粗原料及制造方法而不同。但是，確認了這種雜質(zhì)的大致的副作用是可接受的，其結(jié)果，在很長一段時間里都將未分級的肝素用作藥物。然而，2008年初在美國和德國報告發(fā)生了多起向患者靜脈團注(快速靜注)未分級的肝素制劑時，出現(xiàn)與以往不同的副作用的病例，最終演變成超過80人死亡的事件。美國FDA對這種未分級的肝素制劑及其原料藥進行了分析，結(jié)果確認了其與一直以來所使用的產(chǎn)品存在明顯差異，進一步地確認到了這種產(chǎn)品中存在過硫酸化硫酸軟骨素(Oversulfated chondroitin sulfate:0SCS)(非專利文獻2 4)。這種物質(zhì)是自然界中不存在的物質(zhì)，據(jù)說很可能是在制造原料藥時混入的。日本國內(nèi)雖然沒有重度副作用的報告，但也回收了部分未分級的肝素制劑及低分子肝素(Low molecular weight heparin:LMWH)制劑，向市場穩(wěn)定供應(yīng)的問題變得嚴峻。許多研究人員根據(jù)OSCS的科學(xué)合成法、結(jié)構(gòu)解析或動物實驗等來探明有害現(xiàn)象的原因，特別是還根據(jù)IH-NMR和其他試驗方法等對純度及安全性的確認進行了研究(非專利文獻5和6)，確認OSCS為造成日本國內(nèi)有害現(xiàn)象的原因物質(zhì)，確認/純度實驗的研究通過行政、制劑制造商來實施(非專利文獻7和8)。另一方面，作為肝素的制造或者純化方法，公知有I)非專利文獻1、2)非專利文獻9、3)非專利文獻10和4)專利文獻I等中記載的方法。但是，能夠簡便且有效地從肝素中除去0SCS、硫酸軟骨素等雜質(zhì)的方法，至今為止還是未知的。進一步地，簡便地檢出或測定上述肝素中雜質(zhì)的方法至今為止是未知的。現(xiàn)有技術(shù)文獻非專利文獻非專利文獻I:Roden, L.，Dorfman, A.，Acta Chem1.Scand.13,2121 (1959)非專利文獻2:Nature Biotechnology, 2008, 26,669-675非專利文獻3:The New England Journal of Medicine, 2008, 359, 2674-2684非專利文獻4:The New England Journal of Medicine, 2008, 358, 2457-2467非專利文獻5:Beyer, T.et al., Journal of Pharmaceutical and BiomedicalAnalysis,48,13-19(2008)非專利文獻6:Guerrini, M.et al., Nature Biotechnology26,669-675 (2008)非專利文獻7:橋井則貴6、醫(yī)藥研究39 (10) 651-659 (2008)非專利文獻8: Jia , H., Nature Biotechnology26,477-478 (2008)非專利文獻9:Schiller，S.et al.:J.Biol.Chem.236，983 (1961)非專利文獻10:Schmidt, M and Dmochowski, A:Biochim.Biophys.Acta 83,137(1964)專利文獻專利文獻1:日本特開2002-29380
技術(shù)實現(xiàn)思路
專利技術(shù)要解決的問題本專利技術(shù)的課題在于提供實質(zhì)上不含0SCS、硫酸軟骨素等雜質(zhì)的、安全性高的高純度肝素及其制造方法，以及在其制造過程中肝素純度的確認方法。解決問題的方法本專利技術(shù)人等為解決上述問題進行了深入研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn):通過使用乙醇等有機溶劑在給定條件下對肝素進行分級，能夠簡便且有效地除去0SCS、硫酸軟骨素等雜質(zhì)，進一步地，由于這些雜質(zhì)在給定條件下對亞硝酸分解具有抗性，因此，通過在進行該亞硝酸分解后采用HPLC進行分析，能夠確認及測定它的存在及含量，從而完成了本專利技術(shù)。S卩，本專利技術(shù)中包含以下內(nèi)容:肝素，其實質(zhì)上不含抗亞硝酸分解的雜質(zhì)。肝素，其通過下述方法得到，該方法包括:向5 30重量％的肝素水溶液中混合0.2^1倍量(體積)的選自乙醇、甲醇、異丙醇、丙酮及其混合溶劑的有機溶劑，得到肝素的膠體狀沉淀物。上述所述的肝素，其中，在肝素水溶液中以5(T500mM的濃度溶解有鹽。上述所述的肝素，其中，鹽選自氯化鈉及乙酸鈉。上述 中任一項所述的肝素，其為膠體狀。上述 中任一項所述的肝素，其分子量在300010000道爾頓范圍內(nèi)。肝素的制備方法，該方法包括:向5 30重量％的肝素水溶液中混合0.2^1倍量(體積)的選自乙醇、甲醇、異丙醇、丙酮及其混合溶劑的有機溶劑，得到肝素的膠體狀沉淀物。肝素，其通過下述方法得到，該方法包括:向5 30重量％的肝素水溶液中混合0.2^1倍量(體積)的選自乙醇、甲醇、異丙醇、丙酮及其混合溶劑的有機溶劑，得到含有肝素的上清液。上述所述的肝素，其中，在肝素水溶液中以5(T500mM的濃度溶解有鹽。上述所述的肝素，其中，鹽選自氯化鈉及乙酸鈉。上述 中任一項所述的肝素，其分子量在150(T12000道爾頓范圍內(nèi)。肝素的制備方法，該方法包括:向5 30重量％的肝素水溶液中混合0.2^1倍量(體積)的選自乙醇、甲醇、異丙醇、丙酮及其混合溶劑的有機溶劑，得到含有肝素的上清液。藥物，其含有上述及中任一項所述的肝素。根據(jù)上述及中任一項所述的肝素，其作為藥物而使用。藥物組合物，其含有上述及中任一項所述的肝素。粘多糖中 含有的抗亞硝酸分解的粘多糖或亞硝酸分解性粘多糖的檢測或測定方法，該方法包括:將粘多糖進行亞硝酸分解。專利技術(shù)效果本專利技術(shù)的高純度肝素由于不含引起副作用的物質(zhì)OSCS等、因而安全性高，可優(yōu)選用作藥品、化妝品、研究試劑等使用。根據(jù)本專利技術(shù)的肝素的制備方法，能夠簡便地得到實質(zhì)上不含抗亞硝酸分解的雜質(zhì)的高純度肝素。此外，該方法有可能在工本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護點】

【技術(shù)特征摘要】
【國外來華專利技術(shù)】...

【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：六車三治男，村田浩志，
申請(專利權(quán))人：國立大學(xué)法人宮崎大學(xué)，扶桑藥品工業(yè)株式會社，
類型：
國別省市：