自由脂肪酸受體2在抗腫瘤藥物中的應用制造技術

本發(fā)明專利技術公開了一個自由脂肪酸受體2（FFAR2）在抗腫瘤藥物中的應用。通過給予自由脂肪酸受體2的配體醋酸鈉與丙酸鈉，發(fā)現(xiàn)該配體能夠顯著減少小鼠免疫細胞株Raw264.7的活細胞數(shù)量；通過在人胚腎細胞株HEK293T中過表達FFAR2基因，發(fā)現(xiàn)該細胞系中活細胞的數(shù)量顯著減少；進一步通過小分子核糖核酸介導的基因沉默技術(siRNA技術)，減少HEK293T細胞株中的FFAR2后，細胞株中活細胞數(shù)量顯著增加；進一步通過線粒體膜電位檢測試劑盒檢測發(fā)現(xiàn)，在過表達了FFAR2的HEK293T細胞中，線粒體膜電位顯著降低，提示該基因能夠誘導細胞凋亡；通過細胞凋亡檢測試劑盒（AnnexinV-PI）染色并通過流式細胞儀檢測后，結果提示在過表達了FFAR2的HEK293T細胞中凋亡細胞顯著增加。本發(fā)明專利技術公開自由脂肪酸受體2在抗腫瘤藥物中的應用，其在臨床上對血液系統(tǒng)及其它種類的腫瘤具有潛在的治療作用。

【技術實現(xiàn)步驟摘要】

本專利技術涉及自由脂肪酸受體2 (FFAR2)誘導細胞凋亡的用途。
技術介紹
生物體內各種組織細胞通過增殖與凋亡來維持數(shù)量的平衡。一旦這種平衡被打破就會導致一些疾病的產生，如癌癥。細胞凋亡與癌癥之間的關系為癌癥的治療提供了新思路。近年來的研究發(fā)現(xiàn)細胞凋亡是各種抗癌藥物引發(fā)細胞死亡的主要方式，從而使得細胞凋亡與癌癥之間的關系及細胞凋亡在癌癥治療中的作用成為抗腫瘤研究的新焦點。細胞死亡一般有兩種方式，即細胞壞死(necrosis)和細胞凋亡(apoptosis)。細胞壞死通常發(fā)生在一群接觸的細胞中，是由各種非生理因素，如局部缺血等引起的難以控制的一種破壞現(xiàn)象。它通過干擾細胞能量代謝，引起細胞滲透壓不平衡，細胞質腫脹，最終由溶酶體酶導致細胞結構的不可逆性破壞并誘發(fā)局部的炎癥反應。而細胞凋亡是一種主動的、固有的程序化現(xiàn)象。射線、高溫、毒素及各種抗癌藥物等生理性或非生理性的因素都可以引起細胞凋亡。凋亡的細胞由于失去細胞間相互聯(lián)系而與鄰近細胞分離，隨后細胞表面釋放出信號分子被吞噬細胞識別，因此凋亡不損傷周圍的細胞。同時，凋亡一般伴有明顯的形態(tài)學特征，以細胞核的變化為主，表現(xiàn)為核濃縮、細胞漿中細胞器密集、胞膜突出、體積縮小、DNA斷裂及形成凋亡小體。組成人體的正常細胞是一個復雜和相互依賴的共同管理、相互調控對方的大環(huán)境。一個細胞通過接收生長或者抑制的信號來調節(jié)其增殖，從而使每一種組織得以維持一定的大小和形狀。而癌細胞則與之截然相反，它們對于正常控制增殖的信號不敏感，只遵循它們自己內在的增殖信號。惡性的腫瘤細胞甚至可以移動、入侵鄰近組織，干擾了機體生存所需的器官和組織，并最終導致機體死亡。長期以來，人們認為腫瘤化療的藥物靶細胞是選擇性地針對快速分裂的細胞，但在臨床上有些現(xiàn)象卻無法解釋。因為可治療的癌癥有時生長緩慢，而對化療有抗藥性的癌癥中也可能在快速分裂。而更多的事實表明，化療可能是在腫瘤細胞中誘導相應細胞凋亡，而各種細胞凋亡的閾值不同造成了對不同腫瘤細胞治療的反應不同。如有研究表明在體內用視黃酸處理后T淋巴細胞凋亡；體內對食道癌細胞放療和化療(5-氟尿嘧啶、順鉬，博來霉素)處理后能誘導腫瘤細胞凋亡。因此，誘導細胞凋亡已成為抗腫瘤研究的新焦點。游離脂肪酸(free fatty acids,FFA)是生物體的一種重要能量來源，同時也是一種信號分子，具有多種生理作用。FFA的生理功能及其對機體內的營養(yǎng)代謝疾病的調控作用長期以來受到人們的關注，但由于FFA的特異性膜受體一直未被發(fā)現(xiàn)，關于其分子機制的認識無法進一步深入。而最新研究找到并鑒定了 FFA的特異性膜受體，使科學家們重新認識了 FFA在健康人及患者體內發(fā)揮作用的分子機制。游離脂肪酸受體(FFAR)屬于G蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)家族，而鑒于 目前30%以上的藥物靶標都是GPCR，因此開發(fā)基于FFA受體的高親和力的藥物進而治療如糖尿病等的復雜的疾病，將有著很大的應用潛力。短鏈脂肪酸是腸道菌群消化食物過程的產物，而短鏈脂肪酸亦受體屬于游離脂肪酸受體家族。其中，脂肪酸受體2 (FFAR2)又名GPR43，于1997年首次被克隆，但直到2003年之后才被逐漸重視，之后不斷有重要發(fā)現(xiàn)發(fā)表；尤其是2010年，新發(fā)表論文數(shù)量和質量都是歷年之最，足見目前FFAR2的研究已成為國際上一個新的研究熱點。文獻查閱發(fā)現(xiàn)FFAR2在腸道、胃、骨髓、脾臟、外周血單個核細胞、脂肪等組織均有表達，而在免疫相關組織、腸道、脂肪組織中表達較高，因此目前其研究主要集中在免疫、腸炎、脂肪分化領域。文獻報道，短鏈脂肪酸(Short Chain Fatty Acids, SCFAs)均能一定程度上結合FFAR2并激活下游信號通路但親和力有明顯差異，具體順序為親和力C2 = C3 > C4 > C5 = C6 (數(shù)字代表短鏈脂肪酸中碳原子數(shù))，而長鏈脂肪酸則不能激活其下游信號通路。在炎癥相關研究方面，文獻報道在硫酸葡聚糖(Dextran sulphate sodium, DSS)誘導的腸炎模型中，通過在造模小鼠飲水中添加FFAR2激動劑醋酸鈉(Sodium Acetate)能夠顯著抑制腸道炎癥反應，并緩解腸道損傷指數(shù)。而FFAR2基因敲除小鼠中，醋酸鈉處理并不能夠顯著緩解DSS誘導的腸炎。上述發(fā)現(xiàn)提示FFAR2與SCFA的相互作用可能將食物、胃腸道微生物代謝、免疫系統(tǒng)及炎癥反應在分子機制上的相互作用聯(lián)系起來，并發(fā)揮著重要的調節(jié)作用。然而，上述研究雖然對FFAR2的功能有重要的提示作用，但是有關FFAR2的功能及其作用的分子機制方面還有很多有待探索之處。鑒于FFAR2可能發(fā)揮著重要的生理功能，我們利用文獻中報道的FFAR2的配體-醋酸鹽，利用各種細胞株，研究FFAR2的功能。如圖6所示，其為FFAR2的電腦模擬3D結構圖，其具有7次跨膜結構，灰色區(qū)域代表細胞膜。
技術實現(xiàn)思路
本專利技術的目的是提供自由脂肪酸受體2在抗腫瘤藥物中的應用。自由脂肪酸受體2可以誘導細胞的凋亡。本專利技術提供一個基因-自由脂肪酸受體2在抗腫瘤藥物中的應用。通過給予自由脂肪酸受體2的配體醋酸鈉與丙酸鈉，發(fā)現(xiàn)該配體能夠顯著減少小鼠免疫細胞株Raw264.7的活細胞數(shù)量；通過在人胚腎細胞株HEK293T中過表達FFAR2基因，發(fā)現(xiàn)該細胞系中活細胞的數(shù)量顯著減少；進一步通過小分子核糖核酸介導的基因沉默技術(siRNA技術)，減少HEK293T細胞株中的FFAR2后，細胞株中活細胞數(shù)量顯著增加；進一步通過線粒體膜電位檢測試劑盒檢測發(fā)現(xiàn)，在過表達了 FFAR2的HEK293T細胞中，線粒體膜電位顯著降低，提示該基因能夠誘導細胞凋亡；通過細胞凋亡檢測試劑盒(Annexin V-PI)染色并通過流式細胞儀檢測后，結果提示在過表達了 FFAR2的HEK293T細胞中凋亡細胞顯著增加；本專利技術首次提供自由脂肪酸受體2在抗腫瘤藥物中的應用，其對血液系統(tǒng)及其它種類的腫瘤具有潛在的治療作用。附圖說明: 圖1:FFAR2的配體-醋酸鹽及FFAR2的配體-丙酮酸鹽對Raw264.7細胞生長的影響的不意圖；圖1A是空白組的不意圖；圖1B是25mM的FFAR2的配體_醋酸鹽的不意圖；圖1C是加入25mM的FFAR2的配體-丙酮酸鹽的示意圖；圖1D加入不同濃度的FFAR2的配體-醋酸鹽及FFAR2的配體-丙酮酸鹽的細胞OD值(450nm)的對比圖。圖2:過表達了 hFFAR2的Raw264.7的活細胞數(shù)變化對比圖；圖2A空白組的細胞示意圖；圖2B是過表達了 hFF AR2的Raw264.7的細胞示意圖；圖2C是空白組與過表達了hFFAR2的Raw264.7的細胞與空白組OD值(450nm)的對比示意圖。圖3:通過siRNA技術減少hFFAR2的表達后HEK293T活細胞變化對比圖；圖3A是空白組的示意圖；圖38是通過siRNA技術減少hFFAR2的表達后HEK293T活細胞示意圖；圖3C是通過siRNA技術減少hFFAR2過表達后的HEK293T細胞與空白組OD值(450nm)對比圖。圖4:hFFAR2在HEK293T細胞中過表達后細胞線粒體膜電位的變化對比圖；圖4A是空白組示意圖；圖48是hFFAR2在HEK293T細胞中過表達后細胞線粒體膜電位示意圖；圖4C本文檔來自技高網(wǎng)...

【技術保護點】
自由脂肪酸受體2在抗腫瘤藥物中的應用。

【技術特征摘要】
1.自由脂肪酸受體2在抗腫瘤藥物中的應用。2.根據(jù)權利要求1所述的自由脂肪酸受體2在抗腫瘤藥物中的應用，其特征在于，自由脂肪酸受體2可以誘導細胞的凋亡。3.根據(jù)權利要求2所述的自由脂肪酸受體2在抗腫瘤藥物中的應用，其特征在于，給予小鼠免疫細胞株Raw264.7自由脂肪酸受體2的配體醋酸鹽與丙酸鹽，小鼠免疫細胞株Raw264.7的活細胞數(shù)量減少。4.根據(jù)權利要求3所述的自由脂肪酸受體2在抗腫瘤藥物中的應用，其特征在于，所述丙酮酸鹽和醋酸鹽分別為丙酮酸鈉和醋酸鈉。5.根據(jù)權利要求2所述的自由脂肪酸受體2在抗腫瘤藥物中的應用，其特征在于，在人胚腎細胞株HEK293T中過表達人的自由脂肪酸受體2，經(jīng)過一定時間后，所述...

【專利技術屬性】
技術研發(fā)人員：寧光，石國軍，顧衛(wèi)瓊，楊明蘭，章曉芳，
申請(專利權)人：上海交通大學醫(yī)學院附屬瑞金醫(yī)院，
類型：發(fā)明
國別省市：