本發明專利技術公開了三種姬松茸SSR分子標記及使用其鑒別姬松茸菌株的方法，姬松茸SSR分子標記為：①引物E5’-GTCAATGGAAGGGGT-3’和5’-CATCACCACACACACA-3’；②引物G5’-CCGCTTGGGTTTCATCT-3’和5’-CAAACGCCTCAACCTCA-3’；③引物K5’-CACCGGCGACCTGTA-3’和5’-CGCTGTGGGTATTGAAATGGT-3’。其克服了現有技術中暫無開發使用的姬松茸SSR分子標記，無法利用SSR分子標記對其進行快速的菌株鑒別的問題，具有多態性穩定、檢測快速、使用方便的特點。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及三種姬松茸SSR分子標記、其制備方法及使用其鑒別姬松茸菌株的方法。
技術介紹
姬松鸞拉丁學名Agaricus blazei Murri77，是一種珍稀食藥用菌,它在真菌分類學上屬于擔了菌門、傘菌目、蘑菇科、蘑菇屬，原產于美國、巴西等地，人工栽培始于日本。1992年，福建省農林科學院食用菌中心引進了該菌種，并在國內首次栽培成功(江枝和1993)，而后推廣到全國各地。該菇不僅味道鮮美、營養豐富，而目具有降血壓和抗癌的食療功效(戴玉成和楊祝良2008 ；Dai et al.2009 )?？紤]到該菇的價值極高，自2001年起，我們利用Co6tl輻射誘變篩選姬松茸突變株并獲得一些具有一定程度性狀改變的菌株(江枝和等2003 ;江枝和等2004 ;翁伯琦等2007)，并予推廣。微衛星(microsatellite)序列，又稱為簡單序列重復(simplesequencerepeat,SSR)，是以少數幾個核苷酸(一般2 4個)為重復單位的串聯重復DNA序列。它均勻、隨機、廣泛地分布于真核生物基因組中，且同種生物中微衛星序列的兩側順序常較保守，其特異性引物擴增具有良好的重復性和保真性。由于大多數微衛星序列存在非轉錄區，變異頻率高，因而在品種間具廣泛位點變異。因此，真核生物基因組中微衛星分了標記的開發與利用成為一個熱點。目前對真菌微衛星的研究主要集中在動植物病原菌，食用菌SSR分子標記的開發和應用還非常少(張瑞穎等2010)，多用在香菇、草菇、靈芝屬上，如200710040319、201110146770、200810204544、200810204545、200810204550 等，在姬松茸目前還沒有開發使用的SSR分子 標記，無法利用SSR分子標記進行快速的菌株鑒別。目前已報道的主要開發食用菌SSR引物的途徑有3條:一是基于DNA序列數據設計開發SSR引物。這對于己經擁有豐富EST或基因組DNA序列數據的食用菌是非?？旖莸耐緩?。二是基于ISSR抑制PCR的方法開發微衛星標記。其有過成功的報道，但也有報道稱利用該方法開發金針菇和黑木耳的SSR位點，結果非常不理想?？赡苁怯捎谡婢蚪M中SSR的分布密度相對較低，所以ISSR擴增產物并非完全是SSR之間的序列，這導致該方法獲得的序列中假陽性比較高(張瑞穎等2010)。三是近年來開發出的利用生物素標記SSR探針，與基因組DNA片段雜交后，用抗生物素蛋白吸附雜交片段以富集含SSR序列的基因組片段的方法。
技術實現思路
本專利技術的目的是提供三種姬松茸SSR分子標記其制備方法及使用其鑒別姬松茸菌株的方法，其克服了現有技術中暫無開發使用的姬松茸SSR分子標記，無法利用SSR分子標記對其進行快速的菌株鑒別的問題，具有多態性穩定、檢測快速、使用方便的特點。三種姬松茸SSR分子標記引物的序列如下①引物E 5 ’ -GTCAATGGAAGGGGT-3 ’和 5’ -CATCACCACACACACA-3’ ； ②引物 G 5， -CCGCTTGGGTTTCATCT-3’和 5，-CA AACGCCTCAACCTCA-3，；③引物 K 5，-CACCGGCGACCTGTA-3，和5’ -CGCTGTGGGTATTGAAATGGT-3’。上述無開發出的姬松茸SSR分子標記填補了目前的姬松茸SSR分子標記的空白，使得利用SSR分子標記對姬松茸進行快速菌株鑒別成為可能。上述三種姬松茸SSR分子標記的制備方法包括以下步驟:(I)、CTAB法提取姬松茸基因組DNA:①、稱取0.1g姬松茸CcT輻射誘變菌株J2 J66的菌絲或子實體，用去離子水沖洗干凈后，迅速轉入1.5ml離心管中、加入液氮，迅速用電鉆搗碎，后加入600mlCTAB并于65°C水浴lh，并每20min反轉搖勻一次、加入等體積調制的氯仿-異戊醇，使步驟(I)②獲得的溶液與氯仿-異戊醇體積比24:1，顛倒混勻后，于12000rpm離心6min，取上清液于新管中；@、向上清液中加入其2倍體積的無水乙醇或其2/3體積的異丙醇，于_20°C放置20min，用以沉淀DNA 、步驟(I)④的溶液于12000rpm離心6min,去上清液后,加入75%乙醇清洗DNA于12000rpm離心2min后，再次去上清液、將步驟(I)⑤制得的DNA風干后加入50 μ I的TE緩沖液以溶解DNA備用；由于CTAB法對于不同作物的提取方法略有不同，上述方法是對傳統CTAB方法改良后的基因組DNA提取方法，使用該方法提取的姬松茸基因組DNA得率更高。⑵、利用鏈霉素磁珠富集與生物素標記的探針雜交的技術分離姬松茸基因組DNA的SSR微衛星序列并對其測序；姬松茸遺傳背景知之甚少且基因組數據有限，直接利用DNA序列數據設計開發SSR引物的方法 對姬松茸不適用。利用鏈霉素磁珠富集與生物素標記的探針雜交的技術分離姬松茸基因組DNA的SSR微衛星序列并針對其序列設計SSR分子標記引物是一條效率較高的途徑，對姬松茸最為適用。而且由于該方法制備的SSR分子標記具有多態性穩定的特點，還克服了基于ISSR抑制PCR的方法開發微衛星標記假陽性高的缺點。⑶、針對姬松茸基因組DNA的SSR微衛星序列進行引物設計，并用引物姬松茸基因組DNA進行PCR擴增，通過聚丙烯酰胺凝膠電泳獲得的電泳圖檢測菌株擴增出的特異條帶，從而篩選出能夠通過擴增出的特異條帶進行姬松茸菌株鑒別的SSR分子標記引物:①引物 E 5’ -GTCAATGGAAGGGGT-3’ 和 5’ -CATCACCACACACACA-3 ’ ；②引物 G 5’ -CCGCTTGGGTTTCATCT-3’ 和 5’ -CA AACGCCTCAACCTCA-3’ ； ③引物 K5’ -CACCGGCGACCTGTA-3’ 和 5’ -CGCTGTGGGTATTGAAATGGT-3’。使用上述三種姬松茸SSR分子標記其鑒別姬松茸菌株的方法，其方法包括以下步驟: ⑴、用姬松茸特異SSR分子標記引物:①引物E 5’ -GTCAATGGAAGGGGT-3’和 5， -CATCACCACACACACA-3’ ； ②引物 G 5， -CCGCTTGGGTTTCATCT-3’ 和5’ -CA AACGCCTCAACCTCA-3’ ； ③引物 K 5’ -CACCGGCGACCTGTA-3’ 和5’-CGCTGTGGGTATTGAAATGGT-3’分別對姬松茸基因組DNA進行PCR反應:PCR反應體系為:25μ I的PCR反應體系中包括提取的DNA溶液1μ 1，10nmol/L引物2μ I，其中上下游引物各Ιμ ,2.5mmol/L dNTP 2 μ I, 10XPCR buffer 2.5 μ I, Taq DNA 聚合酶 IU ;PCR 反應程序為:94°C預變性7min ;隨后30個循環，每個循環94°C變性30s，55°C退火30s，72°C延伸30s ;最后 72°C延伸 IOmin ； ⑵、對步驟⑴所得PCR產物進行聚丙烯酰胺凝膠電泳、銀染顯色及拍照得到電泳圖片;(3)、對PCR產物電泳圖片進行條帶多態性分析，通過以下菌株的特異條帶對姬松茸菌株品種進行鑒別:①引物E:缺256bp條帶鑒別出菌株J41 ；142bp條帶鑒別出菌本文檔來自技高網...
【技術保護點】
三種姬松茸SSR分子標記，其特征在于：該分子標記引物的序列如下①引物E?5’?GTCAATGGAAGGGGT?3’和5’?CATCACCACACACACA?3’；?②引物G?5’?CCGCTTGGGTTTCATCT?3’和5’?CA?AACGCCTCAACCTCA?3’；?③引物K?5’?CACCGGCGACCTGTA?3’和5’?CGCTGTGGGTATTGAAATGGT?3’。
【技術特征摘要】
1.三種姬松鸞SSR分子標記，其特征在于:該分子標記引物的序列如下①引物 E 5’ -GTCAATGGAAGGGGT-3’ 和 5’ -CATCACCACACACACA-3’ ； ②引物 G 5， -CCGCTTGGGTTTCATCT-3，和 5， -CA AACGCCTCAACCTCA-3’ ； ③引物 K5’ -CACCGGCGACCTGTA-3’ 和 5’ -CGCTGTGGGTATTGAAATGGT-3 ’。2.根據權利要求1所述的三種姬松茸SSR分子標記的制備方法，其特征在于:其包括以下步驟，(I)、CTAB法提取姬松茸基因組DNA:①、稱取0.1g姬松茸CcT輻射誘變菌株J2 J66的菌絲或子實體，用去離子水沖洗干凈后，迅速轉入1.5ml離心管中、加入液氮，迅速用電鉆搗碎，后加入600mlCTAB并于65°C水浴lh，并每20min反轉搖勻一次、加入等體積調制的氯仿-異戊醇，使步驟(I)②獲得的溶液與氯仿-異戊醇體積比24:1，顛倒混勻后，于12000rpm離心6min，取上清液于新管中、向上清液中加入其2倍體積的無水乙醇或其2/3體積的異丙醇，于_20°C放置20min 、步驟(I)④的溶液于12000rpm離心6min，去上清液后，加入75%乙醇清洗DNA于12000rpm離心2min后，再次去上清液； 、將步驟(I)⑤制得的DNA風干后加入50 μ I的TE緩沖液； ⑵、利用鏈霉素磁珠富集與生物素標記的探針雜交的技術分離姬松茸基因組DNA的SSR微衛星序列并對其測序； ⑶、針對姬松茸基因組DNA的SSR微衛星序列進行引物設計，并用引物姬松茸基因組DNA進行PCR擴增，通過聚丙烯酰胺凝膠電泳獲得的電泳圖檢測菌株擴增出的特異條帶，從而篩選出能夠通過擴增出的特異條帶進行姬松茸菌株鑒別的SSR分子標記引物:①引物 E 5’ -GTCAATGG AAGGGGT-3’ 和 5’ -CATCACCACACACACA-3 ’ ；②引物 G 5’ -CCGCTTGGGTTTCATCT-3’ 和 5’ -CA AACGCCTCAACCTCA-3’ ； ③引物 K5’ -CACCGGC...
【專利技術屬性】
技術研發人員：江枝和，陳堅，陳愛華，李志生，朱炳耀，李占偉，王義祥，雷錦桂，翁伯琦，肖淑霞，黃志龍，
申請(專利權)人：福建省農業科學院土壤肥料研究所，福建省農業科學院生物技術研究所，
類型：發明
國別省市：
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