一種紫花苜蓿抗旱耐鹽基因制造技術(shù)

本發(fā)明專(zhuān)利技術(shù)公開(kāi)了一種紫花苜蓿抗旱耐鹽基因，其氨基酸核苷酸序列如序列表中SEQ?ID?NO.1所示。將該基因轉(zhuǎn)入紫花苜蓿中，能夠提高紫花苜蓿的抗旱耐鹽能力，通過(guò)基因工程手段快速培育抗逆性強(qiáng)的紫花苜蓿品種。要得到抗逆性強(qiáng)的紫花苜蓿品種，還需通過(guò)以下過(guò)程：1將該基因和植物表達(dá)載體pCAMBIA1301用T4連接酶連接，構(gòu)建植物表達(dá)載體；2將表達(dá)載體質(zhì)粒導(dǎo)入農(nóng)桿菌GV3101中，用葉盤(pán)法侵染煙草葉片，潮霉素篩選抗性植株；3所得植株移栽入土，觀察植株生長(zhǎng)狀態(tài)和表型。

【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】

本專(zhuān)利技術(shù)屬于基因工程
，涉及一種紫花苜蓿抗旱耐鹽基因。
技術(shù)介紹
紫花苜蓿(Medicago sativaL.)是世界上分布最廣泛的多年生豆科牧草，目前全世界種植面積達(dá)3000多萬(wàn)hm2，我國(guó)屬世界上栽培利用苜蓿較多的國(guó)家之一。由于其營(yíng)養(yǎng)豐富，適口性強(qiáng)，栽培面積廣，蛋白質(zhì)含量高，因而有“牧草之王”的美稱(chēng)，在畜牧業(yè)生產(chǎn)中發(fā)揮著重要作用。近年來(lái)由于我國(guó)氣候干旱日益嚴(yán)重，草場(chǎng)過(guò)分開(kāi)發(fā)以及管理粗放，極大程度的限制了苜蓿的生產(chǎn)，因此，現(xiàn)階段開(kāi)展提高苜蓿抗逆性的技術(shù)研究具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。但苜蓿的抗逆境遺傳資源匾乏，通過(guò)常規(guī)雜交育種選育抗逆品種不易實(shí)現(xiàn)。近年來(lái)，越來(lái)越多的耐鹽、耐旱、耐冷相關(guān)基因的克隆及植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)的不斷發(fā)展，為選育耐逆苜蓿新品種提供了一種新的技術(shù)途徑，利用基因工程技術(shù)來(lái)提高苜蓿抗旱、耐寒、耐鹽堿能力，改良苜蓿品質(zhì)，選育苜蓿新品種具有重大的生態(tài)效益、社會(huì)效益和經(jīng)濟(jì)效益。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
本專(zhuān)利技術(shù)的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)所存在的上述不足，而提供一種紫花苜蓿抗旱耐鹽基因。其技術(shù)方案為:一種紫花苜蓿抗旱耐鹽基因，其氨基酸核苷酸序列如序列表中SEQ ID N0.1所示。本專(zhuān)利技術(shù)的有益效果:與現(xiàn)有技術(shù)相比，將該基因轉(zhuǎn)入紫花苜蓿中，能夠提高紫花苜蓿的抗旱耐鹽能力，通過(guò)基因工程手段快速培育抗逆性強(qiáng)的紫花苜蓿品種。要得到抗逆性強(qiáng)的紫花苜蓿品種，還需通過(guò)以下過(guò)程:1將該基因和植物表達(dá)載體口0八1^從1301用1'4連接酶連接，構(gòu)建植物表達(dá)載體；2將表達(dá)載體質(zhì)粒導(dǎo)入農(nóng)桿菌GV3101中，用葉盤(pán)法侵染煙草葉片，潮霉素篩選抗性植株；3所得植株移栽入土，觀察植株生長(zhǎng)狀態(tài)和表型。附圖說(shuō)明圖1為Y RACE步驟概要圖；圖2為3' RACE步驟概要圖；圖3為紫花苜蓿抗旱耐鹽基因提取方法技術(shù)路線(xiàn)圖；圖4為Y RACE步驟實(shí)際擴(kuò)增圖；圖5為:V RACE步驟實(shí)際擴(kuò)增圖；圖6為紫花苜蓿抗旱耐鹽基因提取方法實(shí)際擴(kuò)增圖；圖7為轉(zhuǎn)基因植株的鑒定結(jié)果；圖8為本專(zhuān)利技術(shù)紫花苜蓿抗旱耐鹽基因干旱處理結(jié)果圖；圖9為本專(zhuān)利技術(shù)紫花苜蓿抗旱耐鹽基因鹽處理結(jié)果圖。具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施例對(duì)本專(zhuān)利技術(shù)的方法作進(jìn)一步詳細(xì)地說(shuō)明。這兩種方法的結(jié)合可望獲得全長(zhǎng)cDNA基因。5 ! RACE步驟概要如圖1所示:第一鏈引物GSPl同mRNA退火；使用SuperScriptIII (invitrogen)將 mRNA 轉(zhuǎn)錄成 cDNA ;使用 RnaseH(MBI)降解 RNA ;使用玻璃奶純化cDNA ;使用dCTP和TdT對(duì)純化的cDNA加尾；使用簡(jiǎn)并的錨定引物和巢式GSP2 PCR擴(kuò)增帶有dC尾的cDNA ;使用AUAP，UAP和巢式GSP重新擴(kuò)增初步PCR產(chǎn)物。3 ’ RACE步驟概要如圖2所示:3' RACE利用mRNA3 ’ -末端天然存在的Poly (A)尾作為PCR擴(kuò)增的通用引發(fā)點(diǎn)，首先用反轉(zhuǎn)錄酶和01 igo-dT接頭引物對(duì)mRNAs進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，使之轉(zhuǎn)換為cDNA。然后用一個(gè)能與已知外顯子序列區(qū)退火的基因特異引物(GSP)和定位在Poly(A)尾部的接頭引物直接進(jìn)行PCR，擴(kuò)增特異cDNA。紫花苜蓿抗旱耐鹽基因提取方法技術(shù)路線(xiàn)圖如圖3所示，用Trizol法(Invitrogen, USA)提取紫花苜猜葉片 RNA,按 cDNA Synthesis Kit (TAKERA, Japan)使用說(shuō)明書(shū)反轉(zhuǎn)錄為cDNA。用特異性引物Pl、P2和Clonetech的SMART RACE試劑盒自帶引物AUAP (AbridgedUniversal Amplification Primer:GGCCACGCGTCGACTAGTAC)分別擴(kuò)增該基因的 3’端和 5’端序列。測(cè)序后，利用DNAman5.0拼接全長(zhǎng)，找到開(kāi)放閱讀框ORF (Open reading frame,0RF)，在ORF兩端分別設(shè)計(jì)全長(zhǎng)引物P3和P4，利用高保真酶擴(kuò)增該基因的全長(zhǎng)cDNA，然后連接到PMD18-T載體上，轉(zhuǎn)化DH5 α，篩選陽(yáng)性克隆送華大基因測(cè)序。 RACE實(shí)際擴(kuò)增圖如圖4所示，目的條帶長(zhǎng)600bp。RACE實(shí)際擴(kuò)增圖如圖5所示，目的條帶長(zhǎng)1036bp。參照?qǐng)D6，目的條帶全長(zhǎng)為1396bp。轉(zhuǎn)基因植株的鑒定結(jié)果如圖7所示，證明該基因已經(jīng)轉(zhuǎn)入煙草基因組中，引物是潮霉素通用引物，擴(kuò)潮霉素(HYG)上面的一段521bp的序列:(該序列的名稱(chēng))HygF cgattccggaagtgcttgacHygR cgtctgctgctccatacaag干旱處理(20% PEG)下，在0，2，4，8，12和24h取樣，運(yùn)用實(shí)時(shí)定量PCR對(duì)該基因的表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如圖8所示。鹽處理(200mmolNaCl)下，在0，2，4，8，12和24h取樣，運(yùn)用實(shí)時(shí)定量PCR對(duì)該基因的表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如圖9所示。以上所述，僅為本專(zhuān)利技術(shù)最佳實(shí)施方式，任何熟悉本
的技術(shù)人員在本專(zhuān)利技術(shù)披露的技術(shù)范圍內(nèi)，可顯而易見(jiàn)地得到的技術(shù)方案的簡(jiǎn)單變化或等效替換均落入本專(zhuān)利技術(shù)的保護(hù)范圍內(nèi)。本文檔來(lái)自技高網(wǎng)...

【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
一種紫花苜蓿抗旱耐鹽基因，其特征在于，其氨基酸核苷酸序列如序列表中SEQ?ID?NO.1所示。

【技術(shù)特征摘要】
1.一種紫花苜蓿抗旱耐鹽基因，其特征在于，其氨基...

【專(zhuān)利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：韓博，楊培志，呼天明，余成群，張攀，王衛(wèi)棟，張志強(qiáng)，曹玉曼，楊唯梓，
申請(qǐng)(專(zhuān)利權(quán))人：韓博，
類(lèi)型：發(fā)明
國(guó)別省市：